分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)-基因工程的操作程序（遺傳學(xué)課件）

PCR擴(kuò)增技術(shù)內(nèi)容一二三四五聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖PCR反應(yīng)的條件PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR引物PCR技術(shù)的應(yīng)用在1983年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明的。

PCR是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴(kuò)增法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期二、PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期二、PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期三、PCR反應(yīng)的條件PCR反應(yīng)的條件PCR引物：與待擴(kuò)增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸片斷。其長度通常在15~30個(gè)核苷酸之間。簡并引物：簡并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。

四、PCR引物1、基因組克隆2、突變體的鑒定和在PCR過程中有目的的添加核酸序列。五、PCR技術(shù)的應(yīng)用：在引物的5’端參入額外的DNA序列Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的整合轉(zhuǎn)化程序內(nèi)容一二三四Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能共整合轉(zhuǎn)化程序T-DNA染色體整合機(jī)制Ti質(zhì)粒的改造二元共整合轉(zhuǎn)化程序一、Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會(huì)形成根瘤，其根部致瘤特性是由一種革蘭氏陰性土壤農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)的野生型Ti質(zhì)粒介導(dǎo)所致的。Ti質(zhì)粒的圖譜整個(gè)質(zhì)粒160-240kb，其中T-DNA12-24kb。tms

的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)：合成吲哚乙酸；tmr

的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)：合成植物分裂素；tmt

的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)：合成氨基酸衍生物冠癭堿。二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制(一)、損傷的植物根部會(huì)分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸。

二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制（二）、它們能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的vir基因以及根瘤菌染色體上的一個(gè)操縱子表達(dá)。二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制（三）、vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達(dá)產(chǎn)物則與單鏈T-DNA結(jié)合形成復(fù)合物。二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制（四）、復(fù)合物轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞二、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制三、T-DNA的染色體整合機(jī)制四、Ti質(zhì)粒的改造（一）、除去T-DNA上的生長素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因?yàn)榇罅康纳L素和分裂素會(huì)抑止細(xì)胞再生長為整株植物；（二）、除去T-DNA上的有機(jī)堿生物合成基因（tmt）；因?yàn)橛袡C(jī)堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影響植物細(xì)胞的生長；（三）、除去Ti質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體的長度；四、Ti質(zhì)粒的改造（四）、安裝大腸桿菌復(fù)制子，使其能在大腸桿菌中復(fù)制，以利于克隆操作；（五）、安裝植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記，如使用植物基因的啟動(dòng)子和polyA化信號(hào)序列；（六）、安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。五、共整合轉(zhuǎn)化程序六、二元整合轉(zhuǎn)化程序（一）、將外源基因克隆在大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)；（二）、重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株，該菌株攜帶只含vir區(qū)不含T-DNA區(qū)的Ti輔助質(zhì)粒；以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞?；蚬こ痰拿笇W(xué)基礎(chǔ)—限制性核酸內(nèi)切酶內(nèi)容一二三命名斷裂方式定義一、定義定義：這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶。是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完成的，一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種是核酸內(nèi)切限制酶。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解。二、命名限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個(gè)字母：大寫，表示所來自微生物的屬名第一個(gè)字母。第二、三字母：小寫，表示所來自微生物種名第一、二個(gè)字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號(hào)。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。例：EcoRI來自于EscheriacoliRY13的第一個(gè)限制酶。三、斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式：（一）粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片斷。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。

Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’三、斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式：（二）平末端

兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。Sma15’CCCGGG3’

3’GGGCCC5’三、斷裂方式核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式：（三）同裂酶指來源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。（四）同尾酶指來源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。限制片斷的末端連接作用：分子間的連接：不同的DNA片斷通過互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來。分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。分子內(nèi)連接分子間連接基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟內(nèi)容一二基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟基因工程的支撐技術(shù)1、從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段；切2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子；接一、基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟：3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（寄主細(xì)胞），并與之一起增殖；轉(zhuǎn)4、從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了細(xì)胞重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆；增一、基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟：5、從這些篩選出來的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用；檢6、將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。一、基因工程研