第三章 遺傳信息的復(fù)制課件

第三章：遺傳信息的復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制中心法則

(TheCentralDogma)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制有絲分裂細(xì)胞周期（cellcycle）

G1期

S期間期（interphase）

細(xì)胞周期G2期前期(prophase)M期中期(metaphase)

后期(anaphase)

末期(telophase)

第三章遺傳信息的復(fù)制

為什么還要學(xué)習(xí)DNA的復(fù)制?1,詳細(xì)探究DNA復(fù)制的分子機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象有重要的意義人類(lèi)的壽命,疾病…….2,基于復(fù)制原理發(fā)展的生物技術(shù)在工農(nóng)業(yè)上均發(fā)揮著重要的作用.第三章遺傳信息的復(fù)制內(nèi)容提要：●DNA的半保留復(fù)制●與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)●DNA的復(fù)制過(guò)程（大腸桿菌為例）●DNA復(fù)制的其它方式●真核生物中DNA的復(fù)制特點(diǎn)●基于復(fù)制原理的PCR技術(shù)DNA復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制

第一部分

DNA半保留復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)奠定了分子生物學(xué)的基礎(chǔ)第三章遺傳信息的復(fù)制DNA的復(fù)制

由Watson-Crick模型預(yù)言的DNA復(fù)制是半保留式的。半保留復(fù)制（semiconservativeReplication）：每個(gè)子代DNA分子含有一條舊鏈和一條新鏈。第三章遺傳信息的復(fù)制半保留復(fù)制SemiconservativeReplication每個(gè)子代DNA分子含有一條舊鏈和一條新鏈。第三章遺傳信息的復(fù)制DNA的復(fù)制□DNA是遺傳物質(zhì)，作為遺傳物質(zhì)的首要條件是必須能自我復(fù)制?！鮓atson和Crick闡明的DNA模型預(yù)示了DNA具有復(fù)制的能力，通過(guò)氫鍵配對(duì)的方式復(fù)制新鏈?！踉O(shè)想有三種復(fù)制方式：（1）半保留式；（2）保留式；（3）分散式。(1)+(2)+(3)+第三章遺傳信息的復(fù)制曾設(shè)想有三種復(fù)制方式：保留式，半保留式，分散式第三章遺傳信息的復(fù)制1、定義：由親代DNA生成子代DNA時(shí)，每個(gè)新形成的子代DNA中，一條鏈來(lái)自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式稱半保留復(fù)制。DNA的半保留復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制2、實(shí)驗(yàn)證據(jù)（1958Messelson和Stahl）：

MatthewMesselsonFranklinStahl1930.05.241929.10.08第三章遺傳信息的復(fù)制PhotographtakenbyF.L.HolmesofMattMeselsonandFrankStahlin1996,standingatthesitewheretheymetatWoodsHole42yearsearlier.第三章遺傳信息的復(fù)制Meselson-stahl實(shí)驗(yàn)1958年，Meselson等證明DNA的復(fù)制是半保留式的。1．氯化銫超離心技術(shù)的原理

DNA在CsCl溶液中經(jīng)超速離心后，最終停留在某一位置上，這時(shí)離心力的大小正好等于DNA分子在CsCl梯度中的浮力。DNA的浮力是由其密度決定的。根據(jù)離心后DNA在梯度中達(dá)到的平衡位置的不同可以將不同密度的DNA分子分開(kāi)，例如：15NDNA和14NDNA。第三章遺傳信息的復(fù)制2．將E.coli培養(yǎng)在含有“重”同位素15N的培養(yǎng)基中，經(jīng)多個(gè)世代后，細(xì)胞中DNA就標(biāo)記上“重”同位素。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)到14N培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞分裂周期后，分離DNA，再進(jìn)行CsCl離心。3.結(jié)果：經(jīng)一個(gè)世代后，DNA形成了一條中間密度帶。其位于“重”帶和“輕”帶之間。經(jīng)兩個(gè)世代培養(yǎng)后，DNA形成兩條帶，一條中間帶，一條輕帶。更直接的證據(jù)是將在14N中生長(zhǎng)一代的細(xì)胞DNA（15N14N）變性后離心，可以得到一條重帶和一條輕帶。說(shuō)明第一代雜種分子是半保留復(fù)制的產(chǎn)物。雙鏈中一條是親代15N，另一條是新合成14N，DNA為15N14N。第三章遺傳信息的復(fù)制Meselson-stahl實(shí)驗(yàn)TheMeselson-Stahlexperiment

第三章遺傳信息的復(fù)制Meselson-stahl實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋第三章遺傳信息的復(fù)制將H3-胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA,然后用溶菌酶把細(xì)胞臂消化掉,使完整的DNA釋放出來(lái),鋪在透析膜上,通過(guò)放射自顯影的方法觀察DNA復(fù)制的狀態(tài),黑點(diǎn)的濃度和軌跡代表了DNA分子的密度和形狀.Cairns復(fù)制-大腸桿菌復(fù)制的直接證據(jù)第三章遺傳信息的復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制DNA復(fù)制的機(jī)制其核心在于：DNA雙螺旋中的兩條鏈都攜帶相同的信息，其堿基對(duì)是互補(bǔ)的；因此，在復(fù)制過(guò)程中兩條親代鏈分離，分別作為模板引導(dǎo)酶催化的新生互補(bǔ)子鏈的合成，并遵循標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對(duì)原則，兩條新生雙鏈在細(xì)胞分裂時(shí)分別進(jìn)入兩個(gè)子細(xì)胞；第三章遺傳信息的復(fù)制DNA復(fù)制的復(fù)雜性1,DNA分子復(fù)制中的幾何學(xué)問(wèn)題2,雙螺旋鏈的解開(kāi)?3,一種酶僅能催化有限的化學(xué)反應(yīng)4,復(fù)制過(guò)程中的錯(cuò)誤的糾正?5,不同生物DNA復(fù)制的方式及過(guò)程?第三章遺傳信息的復(fù)制

第二部分與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)第三章遺傳信息的復(fù)制(一)引子:DNA分子復(fù)制中的幾何學(xué)問(wèn)題第三章遺傳信息的復(fù)制基因組超螺旋電鏡結(jié)構(gòu)顯示，就整體而言，大腸桿菌的基因組是由大量超螺旋的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的原核生物基因組結(jié)構(gòu)第三章遺傳信息的復(fù)制6.8:140:11000:18000:1DNAdoublehelixNucleosome(10nmfiber)30nmFiberLoopsILoopsIIchromosome第三章遺傳信息的復(fù)制DNA分子復(fù)制過(guò)程的幾何學(xué)第三章遺傳信息的復(fù)制線狀DNA形成的超螺旋第三章遺傳信息的復(fù)制環(huán)狀DNA形成的超螺旋第三章遺傳信息的復(fù)制DNA扭曲與雙螺旋相同（擰緊）DNA扭曲與雙螺旋相反（松開(kāi)）負(fù)超螺旋松弛DNA正超螺旋

大多數(shù)天然DNA都具有負(fù)超螺旋,在復(fù)制的開(kāi)始階段可以緩解由于DNA復(fù)制而造成的超纏現(xiàn)象,當(dāng)原有的負(fù)超螺旋用完時(shí)(5%),就需要引入新的負(fù)超螺旋,以緩解復(fù)制的阻力.第三章遺傳信息的復(fù)制拓?fù)洚悩?gòu)體及拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)體：給定連接數(shù)的DNA分子。拓?fù)洚悩?gòu)酶：I型和II型、DNA促旋酶（ATP）。

第三章遺傳信息的復(fù)制ActionofatypeItopoisomerase.

第三章遺傳信息的復(fù)制ActionofatypeIItopoisomerase.

每一次反應(yīng)可以引入兩個(gè)負(fù)超螺旋第三章遺傳信息的復(fù)制（二）與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、

dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物4、引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物。實(shí)質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。第三章遺傳信息的復(fù)制5、DNA聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶●以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物●反應(yīng)需要有模板的指導(dǎo)●反應(yīng)需要有3

-OH存在●DNA鏈的合成方向?yàn)?

3

第三章遺傳信息的復(fù)制DNA聚合酶的分類(lèi)原核生物的DNA聚合酶：DNA-polⅠ（1958，ArthurKornberg）DNA-polⅡ(1971,ThomasKornberg）DNA-polⅢ(1972,ThomasKornberg）第三章遺傳信息的復(fù)制HewasthefirsttoidentifytheenzymecatalyzingthesynthesisofDNA,polymeraseI.InrecognitionoftheirworkelucidatingthebasicmechanismsofDNAreplication,theywereawardedtheNobelPrizein1959.ArthurKornberg(1918-2007)第三章遺傳信息的復(fù)制HisfatherisArthurKornberg(1918-2007),winnerofthe1959NobelPrizeinMedicine,andhisolderbrotherisRogerD.Kornberg(born1947),winnerofthe2006NobelPrizeinChemistry.科恩伯格的長(zhǎng)子羅杰·科恩伯格子承父業(yè)，也在基因研究領(lǐng)域取得卓越成績(jī)。2006年12月，羅杰·科恩伯格憑借在“真核轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)”研究領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，獨(dú)享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。ThomasKornbergborn1948第三章遺傳信息的復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制

——

對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅠ第三章遺傳信息的復(fù)制323個(gè)氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段

/

Klenow

片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性常用工具酶N端C端木瓜蛋白酶第三章遺傳信息的復(fù)制DNA聚合酶Ⅰ的功能

1.5‘→3’聚合功能

2.3‘→5’外切活性

3.5‘→3’外切活性

(1)切口平移（nicktranslation）；

(2)鏈的置換；

(3)模板轉(zhuǎn)換（template-switching）

4.內(nèi)切酶活性第三章遺傳信息的復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制核酸必須有5’磷酸末端,且已經(jīng)正確配對(duì),以一個(gè)接一個(gè)的方式去除,可以是DNA,也可以是RNA.第三章遺傳信息的復(fù)制——在復(fù)制延長(zhǎng)過(guò)程中

真正催化新鏈核苷酸聚合的酶DNA-polⅢ第三章遺傳信息的復(fù)制性質(zhì)聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生鏈合成--+主要是對(duì)DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時(shí)切除RNA引物并填補(bǔ)其留下的空隙。修復(fù)紫外光引起的DNA損傷DNA復(fù)制的主要聚合酶，還具有3’-5’外切酶的校對(duì)功能，提高DNA復(fù)制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌）第三章遺傳信息的復(fù)制6、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。

第三章遺傳信息的復(fù)制但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來(lái)

DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過(guò)程中起重要作用3‘5‘3‘5‘OHP第三章遺傳信息的復(fù)制7、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNATopisomerase)：拓?fù)洚悩?gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

例：大腸桿菌中的ε蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶Π：該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶第三章遺傳信息的復(fù)制8、DNA解螺旋酶/解鏈酶（DNAhelicase)

通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白沿3’

5’移動(dòng)，而解螺旋酶I、II、III沿5’

3’移動(dòng)。第三章遺傳信息的復(fù)制9、單鏈結(jié)合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein)：穩(wěn)定已被解開(kāi)的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。第三章遺傳信息的復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制第三部分:DNA的復(fù)制過(guò)程（大腸桿菌為例）

雙鏈的解開(kāi)

RNA引物的合成

DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的

DNA片段第三章遺傳信息的復(fù)制DNA的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，常包含富含A、T的區(qū)段叫做復(fù)制原點(diǎn)。

復(fù)制原點(diǎn)常用ori(或o）表示?；靖拍睿旱谌逻z傳信息的復(fù)制復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）富含A－T的3個(gè)13bp的串聯(lián)重復(fù)序列，這可能和雙鏈易于解開(kāi)起始復(fù)制有關(guān)；（2）具有4個(gè)9bp的反向重復(fù)順序，作為蛋白結(jié)合位點(diǎn)；第三章遺傳信息的復(fù)制1、復(fù)制起始點(diǎn)（E.coli-oriC:245bp）GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATTACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串聯(lián)重復(fù)序列反向重復(fù)序列5

3

5

3

第三章遺傳信息的復(fù)制雙鏈解開(kāi)、復(fù)制起始第三章遺傳信息的復(fù)制DnaA蛋白辨認(rèn)起始點(diǎn),形成起始復(fù)合物,HU蛋白促進(jìn)起始;b)DnaB蛋白解螺旋,DnaC蛋白協(xié)助DnaB;1,雙鏈的解開(kāi):

在多種蛋白質(zhì)參與下，DNA解開(kāi)成單鏈（包括RNA聚合酶，協(xié)助DNA雙鏈的解開(kāi)）c)SSB維持單鏈穩(wěn)定;大腸桿菌DNA的復(fù)制過(guò)程第三章遺傳信息的復(fù)制大約20個(gè)DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個(gè)9bp保守序列相結(jié)合第三章遺傳信息的復(fù)制在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna復(fù)制起始復(fù)合物使3個(gè)13bp直接重復(fù)序列變性,形成開(kāi)鏈第三章遺傳信息的復(fù)制解鏈酶六體分別與單鏈DNA相結(jié)合(需DnaC幫助),進(jìn)一步解開(kāi)DNA雙鏈第三章遺傳信息的復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶DnaG

，引發(fā)RNA引物的合成。引物長(zhǎng)度約為幾個(gè)至10個(gè)核苷酸。第三章遺傳信息的復(fù)制引物合成DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶OHSSB3

5

3

5

第三章遺傳信息的復(fù)制

DNA的半不連續(xù)復(fù)制DNA:復(fù)制時(shí)其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復(fù)制。在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致并連續(xù)合成的鏈為前導(dǎo)鏈；合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈為滯后鏈。3、DNA鏈的延伸第三章遺傳信息的復(fù)制

在DNA復(fù)制過(guò)程中，前導(dǎo)鏈能連續(xù)合成，而滯后鏈只能是斷續(xù)的合成5

3

的多個(gè)短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。第三章遺傳信息的復(fù)制

由于DNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，DNA聚合酶Ⅲ只能夠沿5’-3’的方向合成子代DNA鏈，在一個(gè)復(fù)制體中，會(huì)出現(xiàn)前導(dǎo)鏈和滯后鏈背道而馳的情況。在上世紀(jì)60年代，是否有3’-5’的方向的DNA聚合酶？—

沒(méi)有找到！其他合成機(jī)制？分子生物學(xué)家的困惑：第三章遺傳信息的復(fù)制

1968年，岡崎（Okazaki）及其同事進(jìn)行了兩組實(shí)驗(yàn)

第一組實(shí)驗(yàn)是脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌（T4噬菌體）為材料，在培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基中加入同位素3H標(biāo)記的dTTP，經(jīng)30秒后，DNA開(kāi)始復(fù)制，分離DNA，然后在堿中沉淀，變性，讓新合成的單鏈和模板鏈分開(kāi)，再用蔗糖密度梯度離心，以沉降的快慢來(lái)確定片段的大小，再檢測(cè)放射性標(biāo)記，結(jié)果表明被3H標(biāo)記的片段，也就是新合成的片段，沉淀系數(shù)為20S左右，即都是長(zhǎng)1000-2000bp的DNA片段；第三章遺傳信息的復(fù)制第二組實(shí)驗(yàn)是脈沖追逐實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測(cè)早期合成的DNA片段是依然如原來(lái)的短片段，還是連接成了長(zhǎng)片段。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是先進(jìn)行標(biāo)記培養(yǎng)30秒，以后除去同位素繼續(xù)培養(yǎng)幾分鐘，再分離DNA在堿中沉淀，檢測(cè)結(jié)果。先合成的（帶標(biāo)記）的DNA不再是短片段，而和總DNA的情況相似，沉淀系數(shù)為70-120S較長(zhǎng)的片段，這意味著剛開(kāi)始合成的片段都是短片段，以后再連接成長(zhǎng)片段，人們就把最初合成的短片段稱為岡崎片段。第三章遺傳信息的復(fù)制1968年，岡崎提出了半不連續(xù)（semidiscontinuous）復(fù)制模型，也就是說(shuō)前導(dǎo)鏈上的合成是連續(xù)的，只有后滯鏈上的合成才是半連續(xù)的。第三章遺傳信息的復(fù)制岡崎實(shí)驗(yàn)示意圖第三章遺傳信息的復(fù)制第三章遺傳信息的復(fù)制DNA聚合酶催化游離的脫氧核苷酸結(jié)合到新鏈3’末端，使其不斷延長(zhǎng)。5’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol復(fù)制延