精液的稀釋與保存

婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院李繼仁精液的稀釋與保存課時教學(xué)計劃教學(xué)目標(biāo)：使學(xué)生了解精液稀釋液配制及精液稀釋的方法。了解精液保存的三種方法。教學(xué)內(nèi)容：1）精液稀釋；2）精液的保存教學(xué)重點(diǎn)：稀釋液配制與稀釋方法；豬精液的常溫保存；牛精液的冷凍保存。教學(xué)難點(diǎn)：稀釋倍數(shù)的計算；冷凍保存精液的原理教學(xué)方法：講授與討論、播放視頻帶著問題學(xué)精液稀釋液的成分有哪幾類？各有什么作用？配制精液稀釋液的水，要使用什么樣的水？配制精液稀釋液的藥品可以用工業(yè)純嗎？精液稀釋液中加入卵黃，起什么作用？精液稀釋時是將精液倒入稀釋液中嗎？精液常溫保存的溫度是多少？低溫保存的溫度是多少？低溫保存時是要快速降溫還是要緩慢降溫？為什么？冷凍保存精液的稀釋液為什么要加入甘油？稀釋后為什么要放置2~4小時后再凍結(jié)？液氮有哪些理化特性？液氮罐的使用要注意哪些問題？5.4精液稀釋精液稀釋是向精液中加入適宜于精子存活的稀釋液。精液稀釋的目的有兩個：1）擴(kuò)大精液容量，從而增加輸精頭數(shù)，提高公畜利用率；2）延長精子的保存時間及受精能力，便于精液的運(yùn)輸，使精液得以充分利用。精液稀釋液的成分及作用1）營養(yǎng)劑：常用的營養(yǎng)物質(zhì)有葡萄糖、果糖、乳糖、奶和卵黃。主要提供營養(yǎng)以補(bǔ)充精子生存和運(yùn)動所消耗的能量。2）稀釋劑：主要用于擴(kuò)大精液容量，各種營養(yǎng)物質(zhì)和保護(hù)物質(zhì)的等滲溶液都具有稀釋精液、擴(kuò)大容量的作用，只不過其作用有主次之分而已。一般單純用于擴(kuò)大精液量的物質(zhì)多采用等滲氯化鈉、葡萄糖、果糖、蔗糖和奶類等。3）保護(hù)性物質(zhì)（1）緩沖物質(zhì)：常用的有檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀等。精液在保存過程中，隨著精子代謝產(chǎn)物如乳酸和二氧化碳的積累，PH值會逐漸降低，超過一定的限度時，會使精子發(fā)生不可逆的變性。因此，為防止精液保存過程中的PH值變化，常加入一些緩沖劑。（2）防冷抗凍物質(zhì)：在精液的低溫和冷凍保存中，必須加入防冷抗凍劑以防止精子冷休克和凍害的發(fā)生。常用的防冷劑有：卵黃和奶類。（3）抗凍物質(zhì)：常用的抗凍劑有：甘油、二甲亞砜、Tris（三羥甲基氨基甲烷）。（4）抗菌物質(zhì)：主要有：青霉素、鏈霉素和氨苯磺胺、林肯霉素、卡那霉素、多黏霉素和恩諾沙星等。主要是抑制細(xì)菌生長繁殖，延長精子存活時間。（5）非電解質(zhì)和弱電解質(zhì)：可以降低精液的電解質(zhì)濃度，減少電解質(zhì)對精液保存的不良作用。常用的非電解質(zhì)和弱電解質(zhì)有：各種糖類、氨基乙酸、甘氨酸等。（6）其它添加劑：主要作用于改善精子外在環(huán)境的理化特性，以及母畜生殖道的生理機(jī)能，以利于提高受精機(jī)會，促進(jìn)受精卵的發(fā)育。常用的有：

①酶類：如過氧化氫酶能分解精子代謝過程中產(chǎn)生的過氧化氫，β-淀粉酶具有促進(jìn)精子獲能，提高受胎率的作用。②激素類：如催產(chǎn)素、PGE等可促進(jìn)母畜生殖道蠕動有利于精子運(yùn)行而提高受胎率。③維生素類：如維生素B1、B2、B12、C、E等，具有改善精子活率，提高受胎率的作用。稀釋液配制配制時要注意下列事項(xiàng)：①配制稀釋所使用的一切用具必須徹底洗滌干凈，嚴(yán)格消毒；②所用蒸餾水或去離子水要新鮮，藥品要求用分析純或化學(xué)純，配制的稀釋液要嚴(yán)格消毒；③使用的鮮奶需經(jīng)過濾后在水?。?2-95℃）中滅菌10分鐘，卵黃要取自新鮮雞蛋，攪拌要充分；④藥物稱量要準(zhǔn)確，要用分析天平；⑤抗生素、酶類、激素類、維生素等添加劑必須在稀釋液冷卻至室溫時，方可加入。氨苯磺胺可先溶于少量蒸餾水（用量計入總量）中，單獨(dú)加熱至80度，溶解后加入稀釋液。⑥稀釋液要求現(xiàn)配現(xiàn)用，保持新鮮，且要嚴(yán)格消毒。稀釋倍數(shù)和稀釋方法1）稀釋倍數(shù)確定精液以稀釋液進(jìn)行適宜的稀釋可以延長精子的存活時間，但稀釋倍數(shù)超過一定限度，精子的存活即會隨著稀釋倍數(shù)的提高而逐漸下降，以致影響受胎率。精液適宜稀釋倍數(shù)與家畜種類和稀釋液種類有關(guān)。確定稀釋倍數(shù)應(yīng)根據(jù)原精液的質(zhì)量，尤其是精子的活率和密度、每次輸精所需的精子數(shù)、稀釋液的種類和保存方法來確定。一般牛4~6倍，豬1~3倍，兔3~5倍，羊2~4倍、雞1~2倍、犬1~3倍。稀釋倍數(shù)計算：精液稀釋倍數(shù)=原精液的精子密度×輸精劑量×輸精時精子活率/輸精要求的有效精子數(shù)。分裝袋（支）數(shù)=采精量×稀釋倍數(shù)÷輸精劑量例：有一頭種公豬，一次采得鮮精200ml，經(jīng)檢查精子的活力為0.8，精子的密度為2億，預(yù)計在2天內(nèi)輸精，保存后活力不低于0.6，輸精劑量為每袋80ml，要求輸精時有效精子數(shù)不少于20億個。問：本次采得的精液能稀釋多少倍，能分裝多少袋？稀釋倍數(shù)=2×0.6×80÷20=4.8（倍）分裝袋數(shù)=200×4.8÷80=12（袋）2）稀釋方法（1）精液經(jīng)檢查合格后應(yīng)立即進(jìn)行稀釋，越快越好；（2）稀釋時，稀釋液的溫度和精液的溫度必須調(diào)整一致，以30-35℃為宜；（3）稀釋時，將稀釋液沿精液瓶或插入的滅菌玻璃棒緩慢倒入，防止劇烈震蕩；（4）若作高倍稀釋，應(yīng)先低倍后高倍，分次進(jìn)行稀釋；（5）稀釋后精液立即進(jìn)行分裝（一般按一頭母畜的輸精量）保存。稀釋液和精液的溫度必須調(diào)整一致將稀釋液沿精液瓶緩慢倒入精液中5.5精液保存精液保存的目的是為了延長精子的存活時間，便于運(yùn)輸，擴(kuò)大精液的使用范圍?，F(xiàn)行精液保存的方法按保存的溫度分為三種。常溫保存（15~25℃）低溫保存（0~5℃）冷凍保存（-79~-196℃）前兩者保存溫度都在0℃以上，以液態(tài)形式短期保存，故稱液態(tài)精液保存。后者以凍結(jié)形式作長期保存，故稱冷凍精液保存，牛的冷凍精液在生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。常溫保存保存溫度在15-25℃，允許溫度有一定的變動幅度，所以亦稱變溫保存或室溫保存。常溫保存所需設(shè)備簡單，便于普及推廣，特別適宜于豬的全份精液保存。1）原理精子的活動在弱酸性環(huán)境中受到抑制，能量消耗降低，一旦PH值恢復(fù)到中性左右，精子又可復(fù)蘇。常溫利于微生物的生長，因此，還必須加入抗菌素，此外，加入必要的營養(yǎng)物質(zhì)及隔絕空氣等有益于精液保存。2）稀釋液豬精液的稀釋液配方：葡萄糖5克，檸檬酸鈉0.3克，乙二胺四乙酸二鈉0.1克，蒸餾水100毫升，青霉素1000單位，鏈霉素1000微克。常用的豬、馬、綿羊精液常溫保存稀釋液配方表見教材?，F(xiàn)在市場有商品稀釋粉出售。3）保存方法一般是將稀釋后的精液裝瓶密封，用紗布或毛巾包裹好，置于15-25℃溫度中避光存放。①一般保存在17±0.5℃恒溫箱中，每隔12h翻轉(zhuǎn)一次。②旱井保存法：建一個室內(nèi)旱井，里面不積水，應(yīng)干燥。一般用空心水泥管，直徑30公分，高4米左右，底部封死。可使溫度維持在15-20℃，而且夏冬溫度變化不大。③水井保存法：精液用蠟封好以后，用繩子吊入水井4-6米深處，溫度可維持在10-18℃，而且變化幅度不大。④地窖保存法：在地勢較高處，挖一個2-3米地窖，溫度可保持在20℃左右。豬的精液常溫保存原理與稀釋液配制技術(shù)豬的精液稀釋與保存低溫保存1）原理精液稀釋后緩慢降溫至0-5℃保存，利用低溫來抑制精子的活動，降低代謝和能量消耗，抑制微生物生長，以達(dá)到延長精子存活時間的目的。當(dāng)溫度回升后，精子又恢復(fù)正常代謝機(jī)能并維持其受精能力。為避免精子發(fā)生冷休克，在稀釋液中添加卵黃、奶類等防冷物質(zhì)，并采用緩慢降溫的方法。2）低溫保存技術(shù)①降溫處理：稀釋后的精液，為避免精子發(fā)生冷休克，須采取緩慢降溫方法，從30℃降至5-0℃，每分鐘下降0.2℃左右為宜，整個降溫過程大約需1-2小時完成。將分裝好的精液瓶用紗布或毛巾包纏好，再裹以塑料袋防水，置于0-5℃低溫環(huán)境中存放，也可將精液瓶放入30℃溫水的容器內(nèi)，一起置放在0-5℃中，約經(jīng)1-2小時，精液溫度即可降至0-5℃。②保存方法：最常用的方法是將精液放置在冰箱內(nèi)保存，也可用冰塊放入廣口瓶內(nèi)代替；或者在廣口瓶里盛有化學(xué)致冷劑（水中加入尿素、硫酸銨等）的涼水內(nèi)；還可吊入水井深處保存。③升溫處理：低溫保存的精液在輸精前要進(jìn)行升溫處理。升溫的速度對精子影響較小，故一般可將貯精瓶直接投入30℃溫水中即可。牛羊馬驢精液低溫保存稀釋液配方見教材。冷凍保存概念：用精液冷凍稀釋液對精液進(jìn)行稀釋，并按照一定的工藝對精液進(jìn)行降溫，在超低溫（-79℃或-196℃）條件下長期保存精液的方法（過程）。優(yōu)點(diǎn)：冷凍保存解決了精液長期保存的問題，使精液不受時間、地域和種畜生命的限制。1）精液冷凍原理精子在冰點(diǎn)下貯藏時，精子中的水分重新按幾何圖形成冰晶。冰晶是造成精子死亡的主要原因。冰晶只有在一定的溫度范圍內(nèi)即0--60℃才能形成，如在降溫過程中能以極快的速度越過這個溫度區(qū)，則會使水分子來不及形成冰結(jié)晶而造成水分子無次序地排列形成均勻的團(tuán)塊，即玻璃化，玻璃化不會出現(xiàn)原生質(zhì)脫水，不致?lián)p害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。玻璃化是可逆性不穩(wěn)定的，當(dāng)緩慢升溫再經(jīng)過冰結(jié)晶溫度區(qū)域時，玻璃化又先變?yōu)楸Щ僮優(yōu)橐夯跃航鈨鰰r也要快速升溫。加入甘油冷凍保護(hù)劑可減緩結(jié)晶、降低危險溫區(qū)上限，防止冷凍過程中形成大冰晶。2）冷凍精液的冷源冷凍精液的冷源有干冰（即固態(tài)CO2

-79℃）和液氮（-196℃）。液氧（-183℃）易爆炸，不安全。液氦（-269℃）制做成本高。液氮是以空氣為原料，經(jīng)壓縮、冷卻分離出的液化氮。氮是無色、無味、無毒的氣體。在一個大氣壓下，當(dāng)溫度降到-196℃時，氮?dú)饧醋優(yōu)橐簯B(tài)。在-195.8℃時沸騰氣化（使空氣中的水份冷凍而形成白色氣霧），變成氣體時有強(qiáng)大制冷能力。氣化的膨脹率為680倍，因此液氮罐蓋塞要防止密閉，以防內(nèi)壓增大而爆炸。液氮?dú)饣?，會使室?nèi)氧氣相對不足，因此放置液氮的工作室應(yīng)通風(fēng)良好。液氮無殺菌能力。比重(0.808kg/L)。3）液氮容器液氮容器用于貯存冷凍精液和貯存、運(yùn)輸液氮。液氮容器分為開放式和密閉式兩種。在制作和貯存冷凍精液中常用開放式液氮容器。液氮罐有大中小不同的規(guī)格。液氮罐結(jié)構(gòu)包括：

外殼、內(nèi)槽、真空夾層、頸管、蓋塞、提簡、外套。液氮罐應(yīng)該具有絕熱性能好、堅固耐用、使用方便等特點(diǎn)。使用中要防止撞擊、傾倒、定期刷洗保養(yǎng)。液氮罐的構(gòu)造液氮罐的構(gòu)造液氮及液氮罐的使用4）冷凍精液的劑型冷凍精液的劑型亦稱包裝方法、分裝方法。目前廣泛應(yīng)用的劑型有細(xì)管型、安瓿型和顆粒型三種，它們各有利弊。細(xì)管型有0.25、0.5、1.0ML三種容量，是目前國外比較流行的包裝方法。細(xì)管型冷凍效果好；劑量標(biāo)準(zhǔn)化，不易受污染，標(biāo)記鮮明；體積??；適于機(jī)械化生產(chǎn)。但如封口不好，解凍時易破裂；須有裝封、印字等機(jī)械設(shè)備。

5）冷凍保存稀釋液冷凍精液稀揮液的成分一般應(yīng)含有低溫保護(hù)劑（卵黃、奶液）、抗凍保護(hù)劑（甘油等）、維持滲透壓物質(zhì)（糖類、檸檬酸鈉）、抗生素及其他添加劑。冷凍精液的稀釋液根據(jù)配制要求和稀釋的需要，將其分別配制，以便于使用。冷凍精液的稀釋液見教材。①基礎(chǔ)液將糖類、鹽類等可通過高溫消毒的藥品，成批量地配制成溶液，用瓶裝密封保存。②I液根據(jù)每次采精所需要的稀釋液雖，在基礎(chǔ)液中加入一定量的卵黃和抗冷劑等配制成I液，用作精液的第一次稀釋。③Ⅱ液取需要量的I液，按照比例加入經(jīng)滅菌處理的甘油等冷凍保護(hù)劑，配制成含甘油的Ⅱ液，用作精液的第二次稀釋。6）冷凍精液制作步驟（以細(xì)管冷凍精液為例）①精液品質(zhì)檢查，活率達(dá)0.7以上。②等溫Ⅰ液初步稀釋（稀釋倍數(shù)為終倍數(shù)一半）。③紗布包裹放冰箱冷藏室經(jīng)1~1.5h緩慢降溫至0~5℃。④用Ⅱ液進(jìn)行等體積等溫度（0~5℃）稀釋。⑤在原溫度環(huán)境下放置2～4h，使甘油充分滲透進(jìn)入精子體內(nèi)（平衡）。⑥以長為25～133mm，存量為0.25或0.5m1的各種顏色的聚氯乙烯復(fù)合塑料細(xì)管，通過吸引裝置將平衡后的精液進(jìn)行分裝，用聚乙烯醇粉末、鋼珠或超聲波靜電壓封口。⑦支架距液氮面2~2.5㎝，細(xì)管置液氮蒸氣上冷凍5~7min。⑧抽樣2～3支進(jìn)行檢測，合格的進(jìn)行包裝、標(biāo)記（包裝上須明確標(biāo)明公畜品種、編號、生產(chǎn)日期、精子活率及數(shù)量），最后浸入液氮中保存。冷凍精液制作7）冷凍精液的儲存儲存精液時，液氮罐應(yīng)放置在于燥涼爽、通風(fēng)和安全的專用室內(nèi)。內(nèi)專人負(fù)責(zé)，每隔5～7d檢查一次液氮容量。當(dāng)剩余液氮為液氮罐容量的2／3時，須及時補(bǔ)充。同時要經(jīng)常檢查液氮罐的狀況，如發(fā)現(xiàn)罐外殼有小水珠、掛霜或發(fā)現(xiàn)液氮消耗過快時，說明液氮罐的保溫性能有問題，應(yīng)及時更換。每次入庫或分發(fā)，耗損的冷凍精液數(shù)量，月結(jié)算一次。進(jìn)行長期儲存的冷凍精液，每隔半年左右須抽樣檢查精子活率，如發(fā)現(xiàn)有異常情況應(yīng)