植物組織培養(yǎng)基的配制（植物組織培養(yǎng)技術(shù)課件）

培養(yǎng)基成分與種類1培養(yǎng)基的分類2培養(yǎng)基的成分3基本培養(yǎng)基的類型

目錄1培養(yǎng)基的分類2培養(yǎng)基的成分3基本培養(yǎng)基的類型

目錄一、培養(yǎng)基的分類（一）根據(jù)態(tài)相不同：固體培養(yǎng)基（加瓊脂的培養(yǎng)基）

液體培養(yǎng)基（不加瓊脂的培養(yǎng)基）（二）根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程：初代培養(yǎng)基（第一次接種外植體的培養(yǎng)基）繼代培養(yǎng)基（用來(lái)接種繼初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的培養(yǎng)基）生根培養(yǎng)基（用來(lái)誘導(dǎo)試管菌生根的培養(yǎng)基）（三）根據(jù)營(yíng)養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基（只含有大量元素、微量元素、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）完全培養(yǎng)基（在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)質(zhì)以及特殊

添加物的培養(yǎng)基）

1培養(yǎng)基的分類2培養(yǎng)基的成分3基本培養(yǎng)基的類型

目錄二、培養(yǎng)基的成分通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基主要包括：水分、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、介質(zhì)、糖類。（一）水分水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。水分類型：蒸餾水、自來(lái)水、純水等

選擇：研究上，通常用蒸餾水；

生產(chǎn)上，可用高質(zhì)量自來(lái)水。（二）無(wú)機(jī)鹽類類型：大量元素和微量元素大量元素是指植物所需濃度大于0．5mmol／L的元素微量元素是指植物所需濃度小于0．5mmol／L的元素大量元素：碳、氫、氧、氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫碳、氫、氧主要來(lái)源于水。氮：蛋白質(zhì)的主要成分。

大多數(shù)培養(yǎng)基既含有銷態(tài)氮又含銨態(tài)氮。銨態(tài)氮對(duì)植物生長(zhǎng)較為有利。供應(yīng)的物質(zhì)有KN03、NH4NO3等。有時(shí)，也添加氨基酸來(lái)補(bǔ)充氮素。NH4+濃度過(guò)高時(shí)對(duì)培養(yǎng)物有毒害作用磷：磷脂的主要成分，而磷脂又是原生質(zhì)體、細(xì)胞核的重要組成成分。常用的物質(zhì)有磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀等。鉀：調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，同時(shí)是植物體內(nèi)多種酶的活化劑。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以氯化鉀、硝酸鉀等鹽類提供。鉀促植物生長(zhǎng)健壯，增強(qiáng)抗性，莖稈挺拔。鈣：是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，鈣促進(jìn)幼根生長(zhǎng)。常以CaCl2·2H20提供。鎂：鎂影響酶的活性，并決定新陳代謝過(guò)程。硫：硫是含硫氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgS04·7H20提供。微量元素：主要有鐵、錳、鋅、銅、硼、碘、鉬、鈷鐵:

鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶等的組成成分。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。微量元素中，鐵的使用量最大。在制做培養(yǎng)基時(shí)用FeS04·7H20和Na2-EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）結(jié)合成螯合物使用。錳：參與植物的光合、呼吸代謝過(guò)程，影響根系生長(zhǎng)。鋅：是各種酶的構(gòu)成要素，能增強(qiáng)光合作用效率，參與生長(zhǎng)

素的代謝，促進(jìn)生殖器官發(fā)育和提高抗逆性。銅：有促進(jìn)離體根生長(zhǎng)的作用。硼：能促進(jìn)生長(zhǎng)器官的正常發(fā)育，參與蛋白質(zhì)合成或糖類運(yùn)輸。鉬：參與氮素代謝（三）、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分主要包括：各種維生素、肌醇、氨基酸和天然有機(jī)添加物。維生素主要有鹽酸硫胺素（VB1）、鹽酸吡哆醇(VB6)、煙酸（VB3）、抗壞血酸（VC）、泛酸鈣、生物素（VB7）、葉酸（VB11）、鈷胺素、VB2等。一般用量為0.1～1.0mg／L。有時(shí)用量較高。其中鹽酸硫胺素可全面促進(jìn)植物生長(zhǎng)；抗壞血酸有抗氧化功能，防止褐變；鹽酸吡哆醇能促進(jìn)根的生長(zhǎng)。Vc有防止組織變褐的作用。維生素具有熱易變性，易在高溫下降解，可進(jìn)行過(guò)濾滅菌肌醇使用濃度一般為l00mg／L，適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。氨基酸是很好的有機(jī)氮源，是蛋白質(zhì)的組成成分，可直接被細(xì)胞吸收利用，對(duì)外植體的芽、根、胚狀體的生長(zhǎng)、分化均有良好的促進(jìn)作用。

培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。

有時(shí)應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們是含有約20種氨基酸的混合物，用量在10～1000mg／L之間。由于它們營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。天然有機(jī)添加物其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)器官的分化作用不明顯。主要有椰乳、酵母提取液、馬鈴薯、香蕉汁、番茄汁等椰乳：在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中作用明細(xì)，一般使用濃度為10-20%香蕉汁

用量為150～200ml/l。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。?duì)pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)發(fā)育有促進(jìn)作用。馬鈴薯

去掉皮和芽后，加水煮30min，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾，取其濾液使用。用量為150～200g／L。對(duì)pH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。（四）、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開(kāi)花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理生化活動(dòng)。在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用常用的有生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類。生長(zhǎng)素類

常用的生長(zhǎng)素類有IAA(吲哚乙酸)IBA(吲哚丁酸)NAA(萘乙酸)

2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長(zhǎng)。細(xì)胞分裂素類主要有：6-BA(6-芐基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激動(dòng)素)、Zt(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是6-BA。赤霉素GA培養(yǎng)基中添加的是GA3赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70％～100％失效，應(yīng)當(dāng)采用過(guò)濾滅菌法加入。（五）、糖類

糖作為碳源在植物組織培養(yǎng)中是必不可少的，它不僅能夠提供給植物材料能量，而且也能維持一定的滲透壓。常用的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨糖等，麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2％～3％，在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用白糖作為碳源。（六）、介質(zhì)或載體瓊脂(agar)在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂的用量在6～10g／L之間?？ɡz又稱為鹿角菜膠、角叉菜膠?？ɡz的水溶性很好，在70℃開(kāi)始溶解，80℃則完全溶解?？ɡz在國(guó)內(nèi)外組培上已經(jīng)大量使用。（七）、其他物質(zhì)抗生物質(zhì)主要有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等活性炭1培養(yǎng)基的分類2培養(yǎng)基的成分3基本培養(yǎng)基的類型

目錄三、基本培養(yǎng)基的類型1、含鹽量較高的培養(yǎng)基主要包括MS、LS、BL、ER培養(yǎng)基等特點(diǎn)：無(wú)機(jī)鹽濃度高，特別是硝酸根離子、鉀離子和銨離子含量豐富。2、硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基

主要有B5、N6、SH培養(yǎng)基等特點(diǎn)：培養(yǎng)基鹽類濃度較高，氨態(tài)氮含量較低，硝酸鉀和鹽酸硫銨素含量高3、無(wú)機(jī)鹽含量中等的培養(yǎng)基主要有H、Miller、Nitsch培養(yǎng)基等。特點(diǎn)：大量元素含量約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類少但含量高，維生素種類多。4、無(wú)機(jī)鹽低含量的培養(yǎng)基

主要有White、WS、HB培養(yǎng)基等。母液配制一、蝴蝶蘭簡(jiǎn)介

蝴蝶蘭又名蝶蘭，為蘭科蝴蝶蘭屬多年生常綠附生草本觀賞植物，其花朵形似蝴蝶。是世界著名的熱帶蘭花，素有“洋蘭皇后”的美譽(yù)，又因其在年宵盆花排行榜上高高在上，名列前茅，被譽(yù)為“花市皇后”。大辣椒黃金樹綠熊v3一、母液的概念及配制母液的意義母液：培養(yǎng)基中各組分以10倍、100倍甚至1000倍量配制成的濃縮液。意義：1、方便快速配制培養(yǎng)基

2、各成分用量準(zhǔn)確一般大量元素、微量元素、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分分別配制成一個(gè)母液，鐵鹽和鈣鹽為單獨(dú)母液，各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在各種培養(yǎng)基中通常也單獨(dú)配成母液。二、母液配制（以MS鐵鹽為例）（1）計(jì)算培養(yǎng)基鐵鹽母液的稱取量：鐵鹽母液各成分稱取量=培養(yǎng)基配方用量（mg/L）*濃縮倍數(shù)*所配制母液體積(L)配置體積根據(jù)生產(chǎn)產(chǎn)量來(lái)定。計(jì)算時(shí)帶單位如：七水硫酸亞鐵(FeSO4.7H2O)稱取量=27.8mg/L*100*1L=2780mg=2.78g

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）的稱取量=37.3mg/L*100*1L=3730mg3.73g計(jì)算：母液各成分稱取量=培養(yǎng)基配方用量（mg/L）*濃縮倍數(shù)*所配制母液體積(L)

1、MS培養(yǎng)基配制大量元素母液時(shí)，已知母液濃縮倍數(shù)為50倍，母液體積為500ml，則大量中，KNO3、NH4NO3、MgSO4?7H2O的稱取量分別為多少克？2、MS培養(yǎng)基配制微量元素母液時(shí)，已知母液濃縮倍數(shù)為100倍，母液體積為200ml，則微量中，KI、ZnSO4?7H2O的稱取量分別為多少克？3、MS培養(yǎng)基配制有機(jī)物母液時(shí)，已知母液濃縮倍數(shù)為50倍，母液體積為2000ml，則有機(jī)物中，煙酸、肌醇的稱取量分別為多少克？計(jì)算：1、MS培養(yǎng)基配制大量元素母液時(shí)，已知母液濃縮倍數(shù)為50倍，母液體積為500ml，則大量中，KNO3、NH4NO3、MgSO4?7H2O的稱取量分別為多少克？47.5g、41.25g、9.25g2、MS培養(yǎng)基配制微量元素母液時(shí)，已知母液濃縮倍數(shù)為100倍，母液體積為200ml，則微量中，KI、ZnSO4?7H2O的稱取量分別為多少克？0.0166g、0.172g3、MS培養(yǎng)基配制有機(jī)物母液時(shí)，已知母液濃縮倍數(shù)為50倍，母液體積為2000ml，則有機(jī)物中，煙酸、肌醇的稱取量分別為多少克？0.05g、10g（2）稱量電子天平注意事項(xiàng)：干凈、干燥、水平、校正、量程、歸零、讀數(shù)電子天平使用方法：開(kāi)機(jī)-檢查-放燒杯-歸零-放藥品-讀數(shù)-關(guān)機(jī)（3）溶解將蒸餾水或去離子水倒入燒杯中，用玻璃棒輕輕攪動(dòng)使其溶解，使其沉淀后將上清液倒入容量瓶，反復(fù)操作，直至全部藥品完全溶解。注意事項(xiàng)：用溫水、酸、堿或醇等助溶加水宜少不宜多多次反復(fù)溶解（4）定容：將已完全溶解的藥品倒入容量瓶定容至所配制母液的體積（1L）。母液成分比較多時(shí)要注意順序，容量瓶定容后要充分搖勻再倒入廣口瓶?jī)?nèi)保存注意容量瓶的使用：干凈、平視凹液面（5）保存：將定容好的母液充分搖勻后倒入干凈棕色瓶或無(wú)色試劑瓶?jī)?nèi)，貼上標(biāo)簽放入試劑柜或冰箱內(nèi)保存。標(biāo)簽注明母液名稱、配制時(shí)間、母液吸取量=1000/濃縮倍數(shù)ml/L有機(jī)物、激素等要低溫、避光保存，鐵鹽、微量等要避光保存母液配制一、實(shí)訓(xùn)目的：1、了解MS培養(yǎng)基母液成分

2、能正確配制MS培養(yǎng)基母液二、實(shí)訓(xùn)內(nèi)容：1、配制大量元素母液500mL，母液倍數(shù)20倍（大量1：硝酸鉀、硝酸銨、7水硫酸鎂、磷酸二氫鉀大量2：2水氯化鈣）

2、配制鐵鹽母液250mL，母液倍數(shù)100倍三、實(shí)訓(xùn)材料：1、實(shí)訓(xùn)設(shè)備

2、實(shí)訓(xùn)藥品四、實(shí)驗(yàn)步驟五、注意事項(xiàng)培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基（medium）

是離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞、組織和器官等的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分、理化性質(zhì)等直接影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)分化。熱灌裝：1、將配制好的MS培養(yǎng)基母液從冰箱中取出，按順序排列，并逐一檢查是否沉淀或變色，避免使用已失效的母液。2、取少量蒸餾水或去離子水（培養(yǎng)基總量的1/2-2/3的蒸餾水）加入燒杯中。3、按需稱取瓊脂后加入（2）水中加熱攪拌均勻。加入稱好的糖。4、按母液順序和規(guī)定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入燒杯中。（一般最后加激素母液）5、定容。6、調(diào)PH值。用0.1mol/L、0.5mol/L、1mol/LNaOH和HCl調(diào)至所需數(shù)值。7、分裝。8、封口。9、滅菌10、冷卻備用。書寫標(biāo)簽（培養(yǎng)基類型代碼、配制日期、配制人）講

PH應(yīng)根據(jù)所培養(yǎng)的植物種類來(lái)確定。pH過(guò)高，培養(yǎng)基會(huì)變硬；pH過(guò)低，影響培養(yǎng)基的凝固。如何配置1mol/LNaOH100ml?m=CVM=1mol/L*0.1L*40g/mol配制100ml，則NaOH稱取量為4g。冷灌裝1、將配制好的MS培養(yǎng)基母液從冰箱中取出，按順序排列，并逐一檢查是否沉淀或變色，避免使用已失效的母液。2、取少量蒸餾水或去離子水（培養(yǎng)基總量的1/2-2/3的蒸餾水）加入燒杯中。3、按需稱取瓊脂、糖。4、按母液順序和規(guī)定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入燒杯中。（一般最后加激素母液）5、定容。6、調(diào)PH值。用0.1mol/L、0.5mol/L、1mol/LNaOH和HCl調(diào)至所需數(shù)值。7、分裝。8、封口。9、滅菌10、冷卻備用。書寫標(biāo)簽（培養(yǎng)基類型代碼、配制日期、配制人）吸取母液一看二搖三取配制1L培養(yǎng)基母液吸取量ml=（1/母液倍數(shù)）*培養(yǎng)基體積（ml）=(1/50)*1000ml=20ml定容、混勻調(diào)整PH值至5.8過(guò)堿了加酸調(diào)節(jié)過(guò)酸了加堿調(diào)節(jié)分裝、密封滅菌（溫度121℃，時(shí)間20min）3mg/L6-BA*250ml=0.1mg/ml6-BA*x3mg/L6BA*0.250L=0.1mg/ml6-BA*x0.75mg=0.1mg/ml*xx=7.5ml大量Ⅰ母液吸取量（50倍）：2.5ml大量Ⅱ母液吸取量（50倍）：2.5ml微量母液吸取量(200倍)：1.25ml鐵鹽母液吸取量（20倍）12.5m有機(jī)物母液吸取量：甘氨酸（200倍）：1.25ml

鹽酸硫胺素+鹽酸吡哆醇+煙酸：1.25ml

肌醇母液吸取量（50倍）：5ml6-BA:7.5ml

NAA:5ml大量Ⅰ母液吸取量（20倍）：6.25ml大量Ⅱ母液吸取量（20倍）：6.25ml微量母液吸取量(200倍)：1.25ml鐵鹽母液吸取量（100倍）：2.5ml有機(jī)物母液吸取量：甘氨酸（200倍）：1.25ml

鹽酸硫胺素+鹽酸吡哆醇+煙酸：1.25ml

肌醇母液吸取量（50倍）：5ml6-BA:7.5ml

NAA:0.5ml分化：1/2MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+20g/L白糖+4g/L瓊脂壯苗：2/3MS+1g/L蛋白胨+1g/L活性炭+22g/L白糖+4g/L瓊脂生根：1/2MS+1g/L活性炭+0.1mg/LNAA+18g/L白糖+4g/L瓊脂每種500ml25、30、35ml/瓶分化：1/2MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+20g/L白糖+4g/L瓊脂

大量Ⅰ母液吸取量：大量Ⅱ母液吸取量：微量母液吸取量(200倍)：鐵鹽母液吸取量（100倍）：有機(jī)物母液吸取量：甘氨酸（200倍）：

鹽酸硫胺素+鹽酸吡哆醇+煙酸：

肌醇母液吸取量（50倍）：6-BA:NAA:分化：1/2MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+20g/L白糖+4g/L瓊脂500ml，每瓶分50ml，ph6.0

大量Ⅰ母液吸取量：12.5ml大量Ⅱ母液吸取量：12.5ml微量母液吸取量(200倍)：2.5ml鐵鹽母液吸取量（100倍）：5ml有機(jī)物母液吸取量：甘氨酸（200倍）：2.5ml(有機(jī))鹽酸硫胺素+鹽酸吡哆醇+煙酸：2.5ml

肌醇母液吸取量（50倍）：10ml6-BA:12.5ml

NAA:1ml壯苗：2/3MS+1g/L活性炭+22g/L白糖+4g/L瓊脂500ml，每瓶分50ml，ph6.0

大量Ⅰ母液吸取量：大量Ⅱ母液吸取量：微量母液吸取量(200倍)：鐵鹽母液吸取量（100倍）：有機(jī)物母液