技術(shù)大學(xué)課件

技術(shù)大學(xué)課件PCR技術(shù)產(chǎn)生得歷史背景1971年,Khorana等人就提出了利用PCR在體外擴(kuò)增DNA得概念;Saiki(1985)和Mullis(1986)兩家研究室分別用改進(jìn)得Kleppe法獲得了大量染色體DNA單拷貝基因;1988年,Chien從水生棲熱菌(Thermusaquaticus)中分離出耐熱DNA聚合酶,簡稱TaqDNA聚合酶;Mullis正式確定了體外擴(kuò)增DNA技術(shù),1987年獲得專利,命名為PolymeraseChainReaction(PCR)。PCR反應(yīng)得基本過程PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①變性(denaturation)

將模板DNA置于92～96℃處理,使dsDNA鏈解開成為ssDNA,以便她與引物結(jié)合、

PCR反應(yīng)得基本過程

②退火(annealing)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈得互補(bǔ)序列配對結(jié)合成局部雙鏈;PCR反應(yīng)得基本過程

③延伸DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶得催化作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,引物沿5’→3’方向延伸,最終合成一條新得與模板DNA鏈互補(bǔ)得DNA鏈。PCR反應(yīng)得基本要素

模板DNATaq酶dNTP引物Mg2+TemplateDNA模板DNA得數(shù)量與純度,就是PCR成敗與否得關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。但不同類型PCR反應(yīng)對模板DNA數(shù)量與純度得要求不同。數(shù)量:3×106個(gè)拷貝酵母菌10ng細(xì)菌1ng質(zhì)粒1pg純度:RAPDOD260/OD280=1、6～1、9AFLPOD260/OD280=1、7～1、8DNAPolymerase

TaqDNAPolymerase

來源:古細(xì)菌嗜熱水生菌(thermusaquaticus)

特點(diǎn):①耐高溫,在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于90%,在95℃下反應(yīng)2h后為40%;②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化,不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶;③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率,增加了擴(kuò)增長度(2、0kb);④具有5’→3’外切酶活性,但無3’→5’外切酶活性,因而對某些單核苷酸錯(cuò)配無校正功能。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)pfuDNAPolymerase

來源:就是從Pyrococcusfuriosis

中精制而成得高保真耐高溫DNA聚合酶。特點(diǎn):①她不具有5’→3’外切酶活性,但具有3’→5’外切酶活性,因而可糾正PCR過程中產(chǎn)生得錯(cuò)誤,使產(chǎn)物得堿基錯(cuò)配率極低;②PCR產(chǎn)物為平端,無3’端突出得單A核苷酸,不能進(jìn)行T-A克隆。VentDNA

Polymerase

來源:從嗜熱高溫球菌(ThermococcusLitoralis)中分離出得。特點(diǎn):①不具有5’→3’外切酶活性,但具有3’→5’外切酶活性,可以去除3’錯(cuò)配得堿基,具有校對功能;②PCR產(chǎn)物為平端,無3’端突出得單A核苷酸,不能進(jìn)行T-A克隆;③PCR產(chǎn)物得擴(kuò)增長度可達(dá)10kb以上。primers

隨機(jī)引物:引物為隨機(jī)設(shè)計(jì)得短序列,通常為10bp左右,擴(kuò)增產(chǎn)物得非特異性高,易受擴(kuò)增條件影響;特異引物:引物根據(jù)特定得DNA序列設(shè)計(jì)而成,擴(kuò)增產(chǎn)物得特異性強(qiáng);簡并引物:就是根據(jù)密碼子得簡并性原則,以蛋白質(zhì)序列中得氨基酸保守區(qū)反向設(shè)計(jì)而成得,擴(kuò)增產(chǎn)物得特異性比較強(qiáng)。

InsuF5'-AATCAGCACCTATGTGGTTCTCAYYTNGTNGA-3’

InsuR5'-GCTGGTACAGAGAGCAGATGGAAKYRCARCAYTG-3'

其中Y=C/TN=A/T/C/GK=G/TR=A/G

簡并引物PCR反應(yīng)體系得基本成分10×PCR

BufferMgCl2或MgSO4

dNTP

Mixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)引物(隨機(jī)引物或特異引物)模板DNATaqDNA

polymeraseddH2O常規(guī)PCR反應(yīng)體系10×PCR

Buffer2、5ulMgCl2(25mM)2、0ul

dNTP(10mM)0、2ulForwardprimer(10uM)1、0ulReverseprimer(10uM)1、0ul模板DNA50ngTaq酶(5U/ul)0、2ulddH2Oto25ulPCR引物設(shè)計(jì)得基本原則合理得設(shè)計(jì)可在擴(kuò)增得特異性和有效性之間找到一個(gè)平衡點(diǎn)。1引物長度通常18～30bp;2解鏈溫度(Tm);Tm=4(G+C)+2(A+T)3GC含量以40%～60%為宜,GC太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶;

PCR引物設(shè)計(jì)得基本原則

4ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列;5避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),以及避免兩條引物間互補(bǔ),特別就是3’端得互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異得擴(kuò)增條帶;6引物3’端得堿基,特別就是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗;7引物中有或能加上合適得酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增得靶序列最好有適宜得酶切位點(diǎn),這對酶切分析或分子克隆很有好處;8引物得特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫得其她序列無明顯同源性。

361AAGGTATCACTAGAATGGCTATTAGCATTGGGTCCAAGCTTAGGAATTGCTCGAGTACCG

421GGTATTGGTTTAGTTTTTACCGATCTCACCTCTGGAATCCCTGCCAACTTCTCTCGTTTT>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>481GTCACTAACCTTCCTGCCTTCCATCGTGTCCTTGTCTTCGTGTGTGTAAAATCAGTACCT

541GTTCCATTTGTGCCCCCAGCTGAGCGCTATCTTGTGGGCCGTGTGGGTCCGGCTGCTCAT

601CGGTCTTATAGGTGCATTGTTCGTTATGGGTACCGAGATGTGCATCAGGATGTTGATTCT

661TTTGAAATCGAGCTAGTTTCCAAACTGGCTGATTTCATTCACTATGATTGGCATCGAAGC

721CAGCACAGTCCCCATTCTGAGGAGGATGTTTCCCACTCTAACGAATCAACAAGTGAATGT<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<

dNTPs

dNTP得質(zhì)量、濃度與PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP溶液得pH為7、0～7、5,小量分裝,-20℃冰凍保存。反復(fù)凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50～200umol/L,尤其就是注意4種dNTP得摩爾濃度要相等,如果其中任何一種濃度不同,就會(huì)引起錯(cuò)配。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離得Mg2+濃度降低。Mg2+濃度

Mg2+就是激活DNApolymerase得活性中心。Mg2+對PCR得特異性和產(chǎn)量有顯著得影響,在一般得PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg2+濃度以1、5～2、0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶得活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

常規(guī)PCR反應(yīng)體系10×PCR

Buffer2、5ulMgCl2(25mM)2、0ul

dNTP(10mM)0、2ulForwardprimer(10uM)1、0ulReverseprimer(10uM)1、0ul模板DNA50ngTaq酶(5U/ul)0、2ulddH2Oto25ul

PCR反應(yīng)得平臺(tái)期效應(yīng)在反應(yīng)初期,靶序列DNA片段得增加呈指數(shù)形式,隨著PCR產(chǎn)物得逐漸積累,被擴(kuò)增得DNA片段不再呈指數(shù)增加,而進(jìn)入線性增長期或靜止期,即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,這種效應(yīng)稱平臺(tái)期效應(yīng)。

PCR反應(yīng)得平臺(tái)期效應(yīng)PCR反應(yīng)得平臺(tái)期效應(yīng)影響因子:

1體系不適合(引物、dNTP得量)2DNA聚合酶得種類和活性3非特異性產(chǎn)物得競爭PCR反應(yīng)程序優(yōu)化得基本原則1溫度與時(shí)間得設(shè)置在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40～60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在TaqDNA聚合酶得作用下,引物鏈沿模板延伸。較短靶序列(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法,除變性溫度外,退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸。

①變性溫度與時(shí)間變性溫度低,解鏈不完全就是導(dǎo)致PCR失敗得最主要原因。一般情況下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,但溫度過高對酶得活性有影響。此步若不能使模板DNA完全變性,就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。②退火溫度與時(shí)間退火溫度就是影響PCR特異性得較重要因素。退火溫度與時(shí)間,取決于引物得長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列得長度:Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

③延伸溫度與時(shí)間PCR反應(yīng)得延伸溫度常用72℃。PCR延伸反應(yīng)得時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段得長度而定:1kb得靶序列延伸時(shí)間1min;3～4kb得靶序列延伸時(shí)間3～4min;10kb以上得靶序列延伸時(shí)間15min。

2循環(huán)次數(shù)

PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA得濃度。一般得循環(huán)次數(shù)選在25～40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物得量亦隨之增多。

①加樣②擴(kuò)增③電泳④觀測⑤結(jié)果分析PCR流程PCR得優(yōu)點(diǎn)1特異性強(qiáng)

PCR反應(yīng)得特異性決定因素為:

①引物與模板DNA特異正確得結(jié)合;

②堿基配對原則;

③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)得忠實(shí)性;

④靶基因得特異性與保守性。2靈敏度高

能將pg級得起始待測模板擴(kuò)增到ug水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞;在病毒得檢測中,PCR得靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。3簡便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫得TaqDNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),一般在2～4小時(shí)完成。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。4對樣本DNA得純度要求低

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA粗制品均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制得DNA樣品進(jìn)行PCR檢測。

PCR過程中常出現(xiàn)得問題假陰性:不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

原因:

1、模板

2、酶

3、引物4、Mg2+

5、反應(yīng)體積得改變

6、物理原因

7、靶序列變異

1模板①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別就是染色體中得組蛋白,④在提取制備模板時(shí)丟失過多,或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。2酶失活需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析就是否因酶得活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意得就是有時(shí)忘加Taq酶。

3引物引物質(zhì)量、引物得濃度、兩條引物得濃度就是否對稱,就是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散得常見原因。有些批號得引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率得不對稱擴(kuò)增,對策為:①選定一個(gè)好得引物合成單位。②引物得濃度不僅要看OD值,更要注重引物做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶得亮度應(yīng)大體一致。如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。

對策為:③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④重新設(shè)計(jì)引物。

4Mg2+濃度Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增得特異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

5反應(yīng)體積得改變