苦丁茶中熊果酸的大孔樹脂分離純化工藝研究

摘

要：以苦丁茶為研究對象，采用大孔吸附樹脂對苦丁茶中熊果酸的粗提取物進行分離純化。對4種不同型號的大孔吸附樹脂進行靜態(tài)實驗考察，篩選出最佳樹脂，并以該樹脂對苦丁茶中的熊果酸進行動態(tài)吸附及洗脫性能的研究，優(yōu)化大孔樹脂分離熊果酸的工藝參數(shù)。實驗篩選出了以HZ-816型樹脂為上樣樹脂，該樹脂純化熊果酸的優(yōu)化工藝條件為：吸附流速4BV/h，上樣濃度1.40mg/mL，上樣體積225mL，樹脂吸附量可達18.697mg/g；以90%乙醇為洗脫劑，洗脫流速4BV/h，洗脫劑用量10BV，解吸率可達58.57%，再減壓濃縮解吸液得干膏，純度為48.26%。關(guān)鍵詞：苦丁茶；熊果酸；大孔樹脂；分離純化；吸附；解吸0

引言苦丁茶，別稱茶丁、富丁茶?？喽〔柚泻卸喾N活性成分，如維生素、氨基酸、揮發(fā)油、黃酮類化合物、微量元素以及多酚類物質(zhì)等。其味苦、性涼，具有生津止渴、清熱消暑、抑癌防癌、活化血脈等多種生物學(xué)效應(yīng)。熊果酸（UA），又名烏蘇酸，屬于五環(huán)三萜類化合物。在自然界中分布較廣，如在女貞、熊果、枇杷和毛泡桐等天然植物中均有一定含量存在。熊果酸純品為白色或類白色針狀晶體或結(jié)晶粉末。熊果酸本身具有多種很強的開發(fā)價值，比如具備抑制腫瘤、抗炎鎮(zhèn)靜、保護肝臟損傷、抗糖尿病、抑制細菌活性、抗病毒傳播等藥理作用。目前，廣泛應(yīng)用于熊果酸分離純化的方法有：硅膠柱色譜吸附及分步洗脫法和有機溶劑萃取法。然而，上述方法均存在工藝流程復(fù)雜、收率低，且使用的有機溶劑有毒有害等問題。大孔樹脂分離技術(shù)，具有工作效率高、吸附容量大、可再生等諸多優(yōu)點，且采用乙醇作為溶劑進行梯度洗脫，所得產(chǎn)物綠色環(huán)保，安全性高，已逐步在中藥制藥工藝中得到應(yīng)用。

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材料與方法1.1

實驗材料與試劑實驗材料與試劑如表1所示。1.2

實驗儀器與設(shè)備實驗儀器與設(shè)備如表2所示。1.3

分析方法本實驗參照2015版《中國藥典》記載的熊果酸含量測定方法，以熊果酸標準品為對照品，應(yīng)用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法，以紫外-可見分光光度法為分析手段，測定熊果酸含量。1.3.1

檢測波長的確定精密稱取熊果酸標準品，配成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的熊果酸標準品溶液。分別吸取一定量的熊果酸標準品溶液和苦丁茶提取液，置于20mL具塞刻度試管中，于105

℃下?lián)]發(fā)溶劑后，準確加入5%香草醛-冰醋酸溶液200μL，振蕩搖勻；再加入高氯酸試液800μL，搖勻，置于60

℃水浴中加熱15min，用冰醋酸定容至5mL，并置于紫外-可見分光光度計中進行波長掃描，得到熊果酸的檢測波長為548nm。1.3.2

標準曲線的建立精密吸取各對照品溶液0μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL，分別置于20mL具塞刻度試管中，按1.3.1項操作，在548nm波長處測定熊果酸溶液吸光度，得標準曲線方程：A=0.0423C+0.0036，線性濃度范圍0～12μg/mL，R2=0.9993。表明在該濃度范圍內(nèi)，熊果酸濃度C與吸光度值A(chǔ)具有良好的線性關(guān)系。1.4

分離方法1.4.1

樹脂預(yù)處理（1）用去離子水沖洗樹脂，以去除其表面的鹽和無效物質(zhì)；（2）使用95%乙醇浸泡樹脂24h；（3）過濾除去浸泡用的乙醇溶液后再進行醇洗，直到樹脂與去離子水以1:3混合不顯渾濁為止；（4）用蒸餾水洗至樹脂無乙醇氣味；（5）用5%的HCl過柱，浸泡樹脂3h左右，水洗至中性；（6）用2%的NaOH過柱，浸泡樹脂3h左右，水洗至中性后備用。1.4.2

樹脂性能參數(shù)本實驗使用4種不同型號的大孔吸附樹脂對苦丁茶中的熊果酸進行純化性能研究，其主要性能指標如表3所示。1.4.3

靜態(tài)篩選實驗分別精確稱取經(jīng)過預(yù)處理后的HZ-806、HZ-816、HZ-818、HZ-826這4種大孔樹脂1.0g，轉(zhuǎn)移至100mL的三角燒瓶中，向三角燒瓶中加入50mL濃度為1.002mg/mL的苦丁茶熊果酸提取液進行吸附，每隔10min振搖30s，持續(xù)2h，靜置24h，使其達到吸附平衡，計算吸附量及其吸附率。1.4.4

動態(tài)吸附及解吸實驗準確稱取經(jīng)過預(yù)處理的樹脂，通過濕法上樣的方式，裝入樹脂柱中；將一定濃度的熊果酸提取液注入柱內(nèi)，控制流速，使其通過樹脂；收集流出液，并用紫外-可見分光光度法測定熊果酸濃度。在洗脫過程中，解吸液從樹脂柱的上端向下端流動，控制解吸液的流動速度，使用采樣瓶收集流出液，并用紫外-可見分光光度法測定熊果酸濃度。計算吸附率、吸附量和解吸率。1.4.5

純度測定首先，收集優(yōu)化工藝條件下的苦丁茶熊果酸解吸液，測定其吸光度，根據(jù)苦丁茶熊果酸標準曲線方程，計算解吸液中苦丁茶熊果酸的含量。然后，減壓濃縮解吸液至干膏，取出，于烘箱中干燥，稱量干膏重量。重復(fù)三次，最后計算出苦丁茶熊果酸純度。1.5

計算方法在苦丁茶熊果酸的分離純化過程中，參照公式（1）～（3），可計算不同樹脂的吸附量、吸附率及解吸率，以選擇最佳樹脂。參照公式（4），可計算經(jīng)大孔樹脂純化所得苦丁茶熊果酸的純度。

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結(jié)果與討論2.1

靜態(tài)篩選考察結(jié)果通過靜態(tài)吸附與解吸考察實驗，對4種不同種類的大孔吸附樹脂進行篩選，結(jié)果如表4所示。由表4可知，對于吸附苦丁茶熊果酸性能較為優(yōu)異的3種大孔樹脂HZ-816、HZ-818和HZ-826，對苦丁茶中熊果酸的靜態(tài)吸附量分別為21.324mg/g、20.84mg/g、19.367mg/g；洗脫性能較為優(yōu)異的3種大孔樹脂為HZ-816、HZ-818和HZ-826，解吸率分別為65.04%、58.53%和64.58%。綜合考慮吸附與解吸因素，選擇HZ-816型樹脂作為本實驗分離苦丁茶熊果酸的大孔樹脂。2.2

吸附流速對樹脂吸附的影響準確稱量10.00

g已經(jīng)過預(yù)處理的HZ-816型樹脂，通過濕法上樣的方式，裝入樹脂柱中。取體積為200mL、濃度為1.00mg/mL的提取液5份，分別控制吸附流速（2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h、6BV/h）進行動態(tài)吸附實驗考察，測定流出液中苦丁茶熊果酸濃度，并按照公式計算熊果酸吸附量和吸附率，實驗結(jié)果分別如圖1、圖2所示。

由圖1、圖2可知，HZ-816型樹脂對苦丁茶熊果酸的吸附量與吸附率均隨吸附流速的上升而不斷下降，當上樣流速為2～4BV/h時，吸附量與吸附率的減小程度較為平緩，而當流速為5BV/h、6BV/h時，吸附量與吸附率數(shù)值急劇減小。故降低吸附流速，可一定程度提高吸附量與吸附率，但同時也會延長達到吸附平衡所需的時間，從而影響工作效率。綜合考慮，選擇吸附流速為4BV/h。2.3

上樣濃度對樹脂吸附的影響分別量取5份不同濃度的苦丁茶熊果酸提取液200mL，吸附流速保持在4BV/h，對不同上樣濃度（0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL）的苦丁茶提取液進行動態(tài)吸附實驗考察。根據(jù)公式分別計算熊果酸吸附量和吸附率，實驗結(jié)果分別如圖3、圖4所示。

由圖3、圖4可見，HZ-816型樹脂對熊果酸的吸附量隨上樣濃度的增大而不斷上升，而吸附率隨上樣濃度增長而平緩下降。分析原因：在本實驗考察的上樣濃度范圍內(nèi)，HZ-816型樹脂的吸附能力還未達飽和，所以隨著提取液濃度的上升，樹脂吸附量不斷上升，而由于樹脂吸附苦丁茶熊果酸的能力的增加速度慢于濃度的增長速度，所以樹脂吸附率逐步下降。綜合考慮，選擇上樣濃度為1.4mg/mL。2.4

上樣體積對樹脂吸附的影響分別準確量取5份不同體積（150mL、175mL、200mL、225mL、250mL）、濃度為1.4mg/mL的上樣液，控制吸附流速為4BV/h，研究上樣體積對熊果酸吸附量和吸附率的影響，實驗結(jié)果分別如圖5、圖6所示。

由圖5、圖6可知，HZ-816型樹脂對熊果酸的吸附量隨著上樣體積的上升，逐步增大，而吸附率逐步下降。分析原因：當提取液量不斷增加，上樣液中熊果酸含量不斷提高，而上樣體積的增幅遠大于吸附量的增幅，因此吸附率不斷下降。綜合考慮，選取上樣體積為225mL，苦丁茶熊果酸吸附量可達18.697mg/g。2.5

乙醇濃度對樹脂解吸的影響按照上述研究結(jié)論，選擇最佳的苦丁茶熊果酸分離純化工藝方案，采用濕法裝柱，使大孔樹脂吸附熊果酸。分別用濃度為70%、80%、90%、95%的乙醇溶液進行動態(tài)解吸實驗考察，控制解吸液體積為100mL，洗脫流速為4BV/h，測定解吸液中熊果酸的含量，實驗結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，隨著乙醇溶液濃度的增加，大孔吸附樹脂的解吸率不斷上升，但當乙醇濃度高于90%時，解吸率不斷趨于平緩。因此，從經(jīng)濟角度和解吸效率兩方面考慮，選擇90%乙醇溶液為脫附劑。2.6

洗脫曲線取濃度為1.40mg/mL的上樣液225mL，控制吸附流速為4BV/h，以90%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫流速為4BV/h進行解吸，解吸過程中的每一床層體積為一組，測定每組熊果酸的含量，得到洗脫曲線，如圖8所示。

由圖8可知，洗脫曲線對稱性好，洗脫峰集中在2～4BV。采用體積分數(shù)為90%的乙醇能較好地洗脫被HZ-816型大孔吸附樹脂吸附的熊果酸，解吸液體積為9BV（90mL）即可基本上將熊果酸完全洗脫下來，實際使用量略大于9BV，故選擇10BV解吸液用量。2.7

純化結(jié)果取225mL濃度為1.40mg/mL的苦丁茶藥液，保持吸附流速為4BV/h，進行大孔樹脂動態(tài)吸附實驗；選取90%乙醇為解吸液，解吸流速為4BV/h，解吸液體積為10BV（100mL）進行動態(tài)洗脫。收集解吸液，測定吸光度，根據(jù)熊果酸標準曲線方程，計算熊果酸的含量。將解吸液減壓濃縮至膏狀，并按公式計算熊果酸純度，結(jié)果如表5所示。由表5可知，經(jīng)過HZ-816型樹脂純化后，苦丁茶熊果酸的純度從開始的18.76%提高到48.26%。

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結(jié)語通過對大孔吸附樹脂進行