分子印跡技術(shù)在中藥活性成分提取純化中的應(yīng)用進(jìn)展

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引言分子印跡技術(shù)（molecularlyimprintingtechnology，MIT）是一種制備對目標(biāo)分子具有特異性識別和結(jié)合能力的聚合物的技術(shù)。由于制備的分子印跡聚合物具有選擇性高、物理和化學(xué)穩(wěn)定性好、使用壽命長等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于手性分離和底物選擇性分離、色譜分離、固相萃取、藥物分析、化學(xué)或生物傳感器以及模擬酶催化、控釋藥物等方面。中藥活性成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜、類型多樣，加上含量低、性質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致了中藥活性成分分離純化困難。目前中藥活性成分的分離純化主要依賴于硅膠柱色譜、大孔吸附樹脂柱色譜、聚酰胺柱色譜、凝膠柱色譜、高效逆流色譜、制備型高效液相色譜等色譜技術(shù)，不僅溶劑消耗量大、環(huán)境污染嚴(yán)重，而且效率和收率也較低。分子印跡技術(shù)與上述色譜分離技術(shù)相比，其具有許多獨特的優(yōu)點：分子選擇性強(qiáng)，溶劑消耗量小，模板和分子印跡聚合物（molecularimprintedpolymer，MIP）可以回收再利用，從而降低MIP的生產(chǎn)成本。因此，利用分子印跡技術(shù)對中藥活性物質(zhì)進(jìn)行分離富集越來越被研究者所重視。

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分子印跡技術(shù)概述1.1

基本原理首先，模板（即印跡分子）與功能單體通過共價或非共價作用在溶劑中形成復(fù)合物后，通過引發(fā)劑引發(fā)，得到高度交聯(lián)的聚合物。然后，通過物理或化學(xué)（如洗脫、水解等）方法除去模板，聚合物主體上就形成了與模板空間、功能基排列相匹配的具有多重作用位點的孔穴。這種孔穴對模板及與模板結(jié)構(gòu)相似的分子具有特異性結(jié)合能力。1.2

分子印跡聚合物（MIP）的制備目前制備分子印跡聚合物的方法根據(jù)功能單體與模板的結(jié)合方式不同可分為三種。1.2.1

共價鍵法功能單體與模板以共價鍵作用形成復(fù)合物，結(jié)合形式主要有硼酸酯、西佛堿、縮醛（酮）、酯、螯合鍵作用等。該方法的優(yōu)點是MIP的識別位點均勻，選擇性高；缺點是能印跡的模板分子有限，且由于共價鍵作用強(qiáng)，因此脫去模板分子也較為困難，在印跡和再識別過程中，模板和功能單體之間的結(jié)合和解離速度較慢，難以滿足快速分離的要求。1.2.2

非共價鍵法功能單體與模板以非共價鍵作用形成復(fù)合物，結(jié)合形式主要有氫鍵、靜電引力、疏水作用、離子鍵、金屬配位鍵等。非共價鍵法的優(yōu)點是制備過程簡單，識別速度快，模板分子易去除，其識別過程更接近天然的分子識別系統(tǒng)；缺點是結(jié)合位點不均勻，常導(dǎo)致非特異性結(jié)合，易造成峰展寬和拖尾，且由于非共價鍵作用弱，因此強(qiáng)烈依賴于溶劑的極性，難以在水中制備MIP。但由于其適用性廣，目前MIP的制備多數(shù)采用這種方式。1.2.3

空間犧牲法空間犧牲法也叫半共價法，將共價鍵法與非共價鍵法加以綜合，即聚合時功能單體與模板的作用力是共價的，而在識別過程中是非共價的。其優(yōu)點是功能單體和模板分子的結(jié)合和解離速度較快，適于快速識別；缺點是去除模板分子較困難，印跡和再識別時的位點有所不同，使得分子選擇性有所降低。1.3

功能單體的選擇由于所制備的分子印跡聚合物主要通過基體內(nèi)與模板分子相匹配的三維孔穴進(jìn)行識別，而該孔穴主要由功能單體與模板分子聚合再脫去模板分子而形成。因此，選擇合適的功能單體及功能單體與模板分子的比例，對于成功制備對模板分子具有特異性識別能力的分子印跡聚合物至關(guān)重要。比如：當(dāng)模板分子中含有氨基、脂肪醇、脂肪胺等基團(tuán)時，可選擇甲基丙烯酸、酰胺類和吡啶類功能單體；當(dāng)模板分子中含有羧酸或氨基、酰胺基時，可選擇丙烯酰胺（AM）作為功能單體。目前，選擇功能單體較為成熟和可行的方法有紫外光譜法、熒光光譜法、氫核磁共振波譜法以及計算機(jī)模擬計算法。其中，紫外光譜法由于儀器設(shè)備價格低廉、簡單方便、靈敏度較高、易于推廣等優(yōu)勢獲得了較大的認(rèn)可。利用紫外光譜法選擇制備了大葉茜草素分子印跡聚合物的功能單體及其比例，最終選擇甲基丙烯酸為功能單體，功能單體與模板分子比例為4:1。提出了一種簡單的分子印跡方法：僅利用N,O-雙異丁烯酰乙醇胺（NOBE）作為功能單體制得的印跡聚合物比使用混合功能單體（比如NOBE和甲基丙烯酸）制得的印跡聚合物具有更高的選擇性。

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分子印跡技術(shù)在中藥活性成分分離純化中的應(yīng)用2.1

生物堿生物堿是一種來源于生物中含氮的有機(jī)化合物，植物中存在的生物堿大多有明顯的生理活性。2.1.1

分離奎寧采用多孔醋酸纖維膜為支撐體，制備了奎寧分子印跡復(fù)合膜，奎寧在該復(fù)合膜上的結(jié)合量達(dá)到20.6μmol/g，奎寧/辛可寧的分離因子為5.6。以二硫代四乙基秋蘭姆（TED）為鏈轉(zhuǎn)移試劑，采用活性/可控自由基聚合并結(jié)合沉淀聚合法制備均勻球形的奎寧分子印跡聚合物，該印跡微球?qū)δ０宸肿泳哂辛己玫奶禺愖R別性能，與傳統(tǒng)沉淀聚合法相比，其聚合物粒徑增大，分子結(jié)合選擇性提高。2.1.2

分離長春堿采用均勻設(shè)計法，以對模板分子長春堿（VLB）的吸附率為評價指標(biāo)，考察了功能單體甲基丙烯酸（MAA）的用量、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）的用量以及致孔劑（溶劑）等因素。在實驗最優(yōu)條件下制得長春堿分子印跡聚合物，對長春堿的吸附率為88.2%。2.1.3

分離鹽酸黃連素以硅膠為犧牲載體，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體制備了鹽酸黃連素印跡聚合物微球，并對其吸附等溫線進(jìn)行了Scatchard分析，發(fā)現(xiàn)分子印跡聚合物具有兩類不同親和能力的吸附位點，其高親和位點的平衡離解常數(shù)為2.350×10-5

mol/L，最大吸附量為17.410μmol/g。2.1.4

檢測嗎啡基于MWCNT/Titania/Nafion復(fù)合膜將聯(lián)吡啶釕固定在電極表面，得到固相發(fā)光電極，然后再修飾一層選擇性印跡膜，從而制備了一種測定嗎啡的新型ECL-MIP傳感器，該傳感器對溶液中的嗎啡分子具有很高的檢測靈敏度，線性范圍達(dá)1.0×10-9～1.0×10-6

mol/L，檢測限可達(dá)2.0×10-10

mol/L，并且具有良好的穩(wěn)定性及再生能力，有望成為一種靈敏快速、選擇性高、再生性好的嗎啡分析新方法。2.2

黃酮黃酮是目前應(yīng)用分子印跡技術(shù)分離純化最多的天然活性物質(zhì)。2.2.1

檢測蘆丁在金電極表面滴涂石墨烯（GR），通過電沉積技術(shù)沉積納米金（Au）構(gòu)成石墨烯-納米金修飾電極（Au-GR/GE），并以蘆丁為模板分子，鄰氨基酚為功能單體，通過電聚合反應(yīng)在Au-GR/GE表面合成一種對蘆丁具有特異性識別能力的分子印跡傳感器膜。在最佳實驗條件下，其對蘆丁濃度的定量測定線性范圍為6.30×10-7～1.70×10-4

mol/L，檢出限為2.10×10-7

mol/L。2.2.2

分離兒茶素以γ-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的硅膠為載體、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體，制備了EGCG-硅膠表面分子印跡聚合物（SMIP），以pH值為6的去離子水為溶劑，發(fā)現(xiàn)在25℃下SMIP對EGCG的吸附效果最佳，其吸附符合Langmuir等溫吸附模型，吸附動力學(xué)符合假一級和假二級吸附速率方程。在此基礎(chǔ)上采用分子印跡-固相萃取分離EGCG及其結(jié)構(gòu)類似物，結(jié)果顯示：MIPs對EGCG的選擇性系數(shù)分別是其結(jié)構(gòu)相似物EGC、C、EC、GCG和ECG的13、26、12、9和11倍，可用于分離富集實際樣品中的EGCG。以EGCG為模板分子、α-甲基丙烯酸為功能單體，在光冷引發(fā)條件下合成EGCG分子印跡聚合物，利用該聚合物制成分子印跡-固相萃取柱，用于固相萃取茶葉提取物茶多酚，EGCG的回收率達(dá)69.3%，且該分子印跡柱具有較好的穩(wěn)定性和耐用性能，使用20次后其選擇性識別能力仍未降低。以兒茶素EC為模板、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，采用紫外聚合方法合成分子印跡聚合物（EC-MIPs），并制備了分子印跡聚合物填充固相萃取柱（EC-MIPs-SPE），配合電噴霧質(zhì)譜法檢測茶葉中多種兒茶素含量，結(jié)果表明：經(jīng)過EC-MIPs-SPE法預(yù)富集，可以去除94.2%的咖啡因和全部茶堿的干擾，同時可得到4個主要兒茶素信號，其相對強(qiáng)度分別為：EC12.1%、EGC8.2%、ECG35.4%、EGCG45.7%，該法可用于茶葉中微量兒茶素的分離鑒定。2.2.3

分離槲皮素在2009年制備了槲皮素-Zn（Ⅱ）金屬配位分子印跡聚合物，對槲皮素-Zn（Ⅱ）的配合物表現(xiàn)出明顯的吸附選擇性，而對槲皮素結(jié)構(gòu)類似物蘆丁和柚皮素的吸附選擇性較差。2011年，他們再以槲皮素-銅（Ⅱ）配合物為模板分子、n-甲基丙烯酸為功能單體，在強(qiáng)極性溶劑甲醇中合成槲皮素-銅（Ⅱ）金屬配位分子印跡聚合物，對槲皮素-銅（Ⅱ）配合物的最大結(jié)合量達(dá)到61.09μmol/g，同時該印跡聚合物具有優(yōu)良的洗脫與再生性能。2012年，他們又分別采用低溫光引發(fā)和高溫?zé)嵋l(fā)聚合制備槲皮素-鈷（Ⅱ）金屬配位印跡聚合物，考察了不同引發(fā)方式對聚合物的結(jié)構(gòu)、微觀形貌及結(jié)合性能的影響。結(jié)果表明：低溫光引發(fā)的金屬配位分子印跡聚合物具有良好的吸附選擇性。2013年，他們以電子束為輻照射線源，采用輻射聚合法成功制備了槲皮素-Ni（Ⅱ）金屬配位分子印跡聚合物，通過紫外光譜法驗證了槲皮素、Ni（Ⅱ）及功能單體甲基丙烯酸三者發(fā)生了金屬配位印跡作用。采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）活性/可控自由基聚合法，制備了槲皮素印跡聚合物。與傳統(tǒng)自由基聚合法相比，采用RAFT自由基聚合法得到的聚合物吸附效率更高。將合成的槲皮素印跡聚合物應(yīng)用于維藥祖卡木顆粒成分分析，得到了較好的分離富集效果。以聚偏氟乙烯微孔濾膜為支撐膜，制備了以槲皮素配合物為模板的鋅離子配位分子印跡聚合物膜，該復(fù)合膜能夠根據(jù)底物分子體積大小以及其官能團(tuán)選擇性識別印跡分子，對槲皮素具有很高的選擇性。在碳納米管（CNT）獨特的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能作用下，以吡咯為功能單體、槲皮素為模板分子，采用電聚合方法制備了槲皮素的分子印跡聚合物膜修飾電極（PPy/CNT/GCEMIP），該修飾電極能顯著提高槲皮素的氧化峰電流，降低氧化峰電位，并可在與其結(jié)構(gòu)相似的桑色素等黃酮類物質(zhì)的存在下，實現(xiàn)對槲皮素的選擇性測定。以重氮甲烷為修飾劑，對合成的槲皮素分子印跡聚合物（MIP）的結(jié)合點進(jìn)行了選擇性修飾。結(jié)果表明：選擇性修飾能明顯提高M(jìn)IP的識別能力與吸附速度，以柚皮素為競爭分子，分離因子可從修飾前的1.60提高到修飾后的3.06，吸附平衡時間從修飾前的100min減少至修飾后的60min。2.2.4

分離木犀草素以木犀草素為模板分子、丙烯酰胺為功能單體、EGDMA為交聯(lián)劑，合成了木犀草素印跡聚合物，并將該印跡聚合物用于固相萃取，分離提取了花生殼中的木犀草素，得到的木犀草素純度高出硅膠柱分離近20個百分點，達(dá)到96.2%，且MIPs-SPE柱經(jīng)過洗脫再生后可以反復(fù)使用多次。2.2.5

分離黃芩苷以介孔分子篩MCM-41為基質(zhì)、黃芩苷（BA）為模板分子，采用熱聚合法合成黃芩苷的表面分子印跡聚合物，并對其形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，表明合成的黃芩苷表面分子印跡聚合物仍然保留了MCM-41的介孔結(jié)構(gòu)，并且對黃芩苷具有良好的吸附能力。2.2.6

分離葛根素以葛根素為模板分子、丙烯酰胺或甲基丙烯酸為功能單體，合成了葛根素印跡聚合物，并使用量子化學(xué)的方法對模板分子與功能單體的結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行了計算機(jī)模擬，然后將合成的分子印跡聚合物填充于固相萃取柱中，用于葛根提取液中葛根素的分離純化。結(jié)果表明：該分子印跡聚合物對葛根素具有高度的選擇性。2.3

甾體目前對甾體的研究主要集中在人參皂苷。由于其相對分子質(zhì)量與極性較大，選擇的致孔劑極性亦較大，易影響聚合物制備過程中模板分子與功能單體之間氫鍵的形成，從而導(dǎo)致MIP制備難度較大。分別采用沉淀聚合法和表面印跡法制備了Rg1分子印跡聚合物，發(fā)現(xiàn)表面印跡法制備的聚合物吸附性要明顯高于沉淀聚合法制備的聚合物，其最大表觀吸附量分別是46.80mg/g、27.74mg/g。以人參皂苷Re作為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體，原位熱引發(fā)聚合制備了人參皂苷Re分子印跡整體柱，表現(xiàn)出對Re的特異性吸附性能，分離因子為1.769，吸附遵循反Langmuir型等溫線模型，飽和吸附量為0.247mg/g。2.4

萜類2.4.1

分離青蒿素以青蒿素為模板分子、丙烯酰胺為功能單體，制得分子印跡聚合物。Scatchard模型分析表明，該分子印跡聚合物在識別青蒿素分子的過程中存在兩類不同的結(jié)合位點：高親和力結(jié)合位點和低親和力結(jié)合位點的離解常數(shù)分別為1.87mmol/L、48.5mmol/L，最大表觀結(jié)合常數(shù)分別為27.99

μmol/g、334.4μmol/g。2.4.2

分離芍藥苷采用溶膠-凝膠法合成了以芍藥苷為模板分子的分子印跡聚合物，并將印跡層接枝到二氧化硅微珠的表面，填充至玻璃層析柱中，利用該分子印跡聚合物從4g桂枝茯苓膠囊甲醇溶液中制得芍藥苷及其結(jié)構(gòu)類似物197mg，芍藥苷純度達(dá)89.3%。2.5

香豆素對載體膜種類、引發(fā)劑與交聯(lián)劑用量以及載體膜在預(yù)聚合溶液中的浸泡時間進(jìn)行優(yōu)化，最終確定聚偏氟乙烯（PDVF）為載體膜、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，固定模板、單體及交聯(lián)劑的加入量比為1:4:8，在乙腈中用AIBN引發(fā)聚合反應(yīng)，制備了一種對香豆素具有良好吸附作用的分子印跡復(fù)合膜，其吸附容量達(dá)0.151

8mmol/g，印跡因子是2.09；并探討了在濃度差驅(qū)動下膜的傳質(zhì)機(jī)制是溶解-擴(kuò)散機(jī)理，且從桂枝甲醇粗提液中提取分離香豆素的回收率達(dá)到了89.6%。

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結(jié)語2016年，中藥大健康產(chǎn)業(yè)規(guī)模已突破萬億元，戰(zhàn)略性地位日益凸顯，而中藥發(fā)展所面臨的質(zhì)量和資源方面的困境，也亟待突破。因此，尋找高效率、低