75%乙醇對(duì)黑曲霉菌的殺滅效果研究

摘

要：目的：了解一定時(shí)間內(nèi)75%乙醇對(duì)黑曲霉菌的殺滅效果。方法：采用75%乙醇對(duì)黑曲霉菌菌懸液進(jìn)行定量殺菌試驗(yàn)，分別用2mL

75%乙醇對(duì)2mL菌懸液進(jìn)行作用、4mL

75%乙醇對(duì)4mL菌懸液進(jìn)行作用、6mL

75%乙醇對(duì)6mL菌懸液進(jìn)行作用、8mL

75%乙醇對(duì)8mL菌懸液進(jìn)行作用、10mL

75%乙醇對(duì)10mL菌懸液進(jìn)行作用，作用時(shí)間為40min。結(jié)果：部分平皿有菌落生長，生長菌落的時(shí)間點(diǎn)不同，菌落數(shù)均小于菌懸液對(duì)照組的2%，通過3組試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，被75%乙醇?xì)绲木淇偲骄戎禐?9.781%。結(jié)論：75%乙醇對(duì)黑曲霉菌有較強(qiáng)的殺滅效果，但在一定時(shí)間范圍內(nèi)，黑曲霉菌沒有完全被75%乙醇?xì)?。關(guān)鍵詞：75%乙醇；菌懸液；黑曲霉菌；殺滅效果

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引言75%乙醇是較為常用的消毒液，試驗(yàn)室通常用75%乙醇消毒桌面、臺(tái)面以及潔凈區(qū)房間，甚至用75%乙醇浸泡帶菌物品。按照2017年版消毒技術(shù)規(guī)范（2.1.1.9真菌殺滅試驗(yàn)）規(guī)定，消毒劑對(duì)黑曲霉菌的殺滅對(duì)數(shù)值≥5.00。黑曲霉菌（Aspergillusniger）是一種常見真菌，早在2002年版消毒技術(shù)規(guī)范關(guān)于試驗(yàn)指標(biāo)菌的規(guī)定中，黑曲霉菌被定為致病性真菌的代表。鑒于黑曲霉菌培養(yǎng)的特殊性，一些研究者對(duì)其進(jìn)行了檢測，并做了有關(guān)消毒劑對(duì)黑曲霉菌殺滅效果的評(píng)價(jià)，但對(duì)一定時(shí)間內(nèi)消毒劑對(duì)黑曲霉菌的殺滅效果評(píng)價(jià)報(bào)道較少。為了解75%乙醇消毒液在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)黑曲霉菌的消毒效果，本文對(duì)黑曲霉菌菌懸液進(jìn)行了殺菌試驗(yàn)，以研究75%乙醇對(duì)黑曲霉菌的殺滅效果。

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儀器與材料1.1

儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱；生物安全柜。1.2

材料沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；黑曲霉菌[CMCC（F）98003]；0.9%無菌氯化鈉溶液；吐溫-80；75%乙醇。

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試驗(yàn)方法2.1

黑曲霉菌孢子懸液的制備首先，取黑曲霉菌[CMCC（F）98003]凍干菌種管，用麥芽浸膏肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，再經(jīng)過沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板劃線進(jìn)行分離培養(yǎng)，選取單個(gè)典型菌落接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在23℃條件下培養(yǎng)7天，得到新鮮培養(yǎng)物。然后，取5mL

0.9%無菌氯化鈉溶液洗下斜面上的孢子，將孢子洗脫。最后，采用無菌注射器吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1mL含黑曲霉菌孢子數(shù)100～200CFU的孢子懸液備用。2.2

中和劑的制備取含20g/L吐溫-80的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）作為中和劑，能起到有效中和75%乙醇對(duì)試驗(yàn)菌的殘留作用。2.3

75%乙醇對(duì)黑曲霉菌的殺菌試驗(yàn)將75%乙醇分裝成0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL的消毒液（陽性對(duì)照用0.9%無菌氯化鈉溶液），置于室溫下備用；取分別2mL、4mL、6mL、8mL、10mL的黑曲霉菌孢子懸液（黑曲霉菌孢子數(shù)100～200CFU）于5支無菌試管中。然后，用不同體積的75%乙醇分別對(duì)5個(gè)不同體積的孢子懸液進(jìn)行作用至預(yù)定時(shí)間，取0.5mL菌藥混合液加入至4.5mL的中和劑（含20g/L吐溫-80的TSB）管內(nèi)。中和作用10min，取樣品液接種進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)，計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值。該試驗(yàn)重復(fù)3次。

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試驗(yàn)結(jié)果上述試驗(yàn)重復(fù)做3次，試驗(yàn)結(jié)果及分析分別如表1、表2、表3所示。在表1中，0

mL的75%乙醇為菌懸液對(duì)照組。黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合后，每組數(shù)據(jù)顯示黑曲霉菌均已被大幅度殺滅。2mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；4

mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35

min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；6mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30min后有2個(gè)黑曲霉菌菌落生長；8mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，8mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；10mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，10mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長。上述5組試驗(yàn)生長的菌落數(shù)均小于菌懸液對(duì)照組的2%，生長黑曲霉菌的時(shí)間點(diǎn)不是隨著時(shí)間的變化而變化，大部分的黑曲霉菌已經(jīng)被殺滅，殘留極少的黑曲霉菌在混合液中分布不均勻。因此，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都可能會(huì)生長黑曲霉菌。另外，35min內(nèi)黑曲霉菌沒有完全被殺滅，未被消毒液殺滅的菌落平均比值為0.183%。在表2中，0

mL的75%乙醇為菌懸液對(duì)照組。黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合后，每組數(shù)據(jù)顯示黑曲霉菌均已被大幅度殺滅。4mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；6mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合15min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，6mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20min后有2個(gè)黑曲霉菌菌落生長，6mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30

min后有2個(gè)黑曲霉菌菌落生長；8mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；10mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，10mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合25min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，10mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合40

min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長。上述5組試驗(yàn)生長的菌落數(shù)均小于菌懸液對(duì)照組的2%，生長黑曲霉菌的時(shí)間點(diǎn)不是隨著時(shí)間的變化而變化，大部分黑曲霉菌已經(jīng)被殺滅，殘留極少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都可能生長黑曲霉菌。另外，40min內(nèi)黑曲霉菌沒有完全被殺滅，未被消毒液殺滅的菌落平均比值為0.283%。在表3中，0

mL的75%乙醇為菌懸液對(duì)照組。黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合后，每組數(shù)據(jù)顯示黑曲霉菌均已被大幅度殺滅。2mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30

min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；4mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20

min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，4

mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合25min后1個(gè)有黑曲霉菌菌落生長，4mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；6mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合25min后有2個(gè)黑曲霉菌菌落生長；8mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長。上述5組試驗(yàn)生長菌落數(shù)均小于菌懸液對(duì)照組的2%，生長黑曲霉菌的時(shí)間點(diǎn)不是隨著時(shí)間的變化而變化，大部分黑曲霉菌已經(jīng)被殺滅，殘留極少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都可能生長黑曲霉菌。另外，35min內(nèi)黑曲霉菌沒有完全被殺滅，未被消毒液殺滅的菌落平均比值為0.192%。通過對(duì)上述3次試驗(yàn)結(jié)果分析，可得出每次黑曲霉菌未被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎担瑥亩?jì)算出每次已被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎?，進(jìn)而算出已被75%乙醇?xì)绲木淇偲骄?。綜合分析結(jié)果如表4所示。通過重復(fù)3次的試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，75%乙醇對(duì)菌懸液作用40min內(nèi)，未被75%乙醇?xì)绲木淇偲骄戎禐?.219%。第1次試驗(yàn)結(jié)果已被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎禐?9.817%，第2次試驗(yàn)結(jié)果已被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎禐?9.717%，第3次試驗(yàn)結(jié)果已被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎禐?9.808%，由此可得3次試驗(yàn)已被75%乙醇?xì)绲木淇偲骄戎禐?9.781%。

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試驗(yàn)討論本次研究重復(fù)3次試驗(yàn)，3次試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)有一定的差距，試驗(yàn)全過程均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，需要用的試管、吸管、平皿等器具均通過濕熱滅菌后方可使用，試驗(yàn)前開啟紫外燈對(duì)生物安全柜滅菌消毒20min，消毒完畢待風(fēng)機(jī)運(yùn)行30min后進(jìn)行試驗(yàn)。3次試驗(yàn)操作人員不變，操作時(shí)間、操作人員的動(dòng)作