生物醫(yī)學科研：研究方法

生物醫(yī)學科研

──基本知識和技能第三章

生物醫(yī)學研究方法現代醫(yī)學科學研究特點一是研究更為深入，利用現代生物學先進技術，在核酸、蛋白質等生物大分子水平上闡述生命體的結構和功能特征，并且利用基因技術使人們能夠設計和改變生物體特征?，F代醫(yī)學科學研究特點二是研究技術的綜合應用，以往各學科單一的研究方法系統(tǒng)正在被跨學科多水平的實驗體系所取代，高水準的研究一般都在整體、離體組織、細胞、分子多種水平上證實一種論點。現代醫(yī)學科學研究特點三是高新技術的采用，使得無損傷非侵入式研究越來越廣泛采用，不僅可以在實驗動物上得出與人更接近的結果，還能直接用于人體的研究。一、研究方法的類型和選用原則（一）不同層次的研究方法1、分子水平2、細胞水平3、組織或器官水平4、整體水平5、人體研究一、研究方法的類型和選用原則（二）不同學科的研究方法1、生理學方法2、生化學方法3、形態(tài)學方法4、免疫學方法5、藥理學方法一、研究方法的類型和選用原則6、計算機技術（1）訊號分析（2）圖像分析（3）動態(tài)測量和遙測（4）信息貯存、處理和共享bioinformatics一、研究方法的類型和選用原則7、生物物理學方法生物物理學方法在生物分子理化特點闡明、大分子立體構型測定、各種藥物分子設計等方面發(fā)揮了積極作用。現代結構生物學（structuralbiology）的興起。一、研究方法的類型和選用原則（三）研究方法的選擇原則①功能的表現形式，如物理現象（電活動、機械力等）、化學現象（物質、能量改變及其調控方式）、形態(tài)學特點（宏觀和微觀的改變、空間定位等）、行為學改變（如學習記憶、自發(fā)活動等）。②生物分子的定性、定量、定位，時間過程，與功能的聯(lián)系。根據這些考慮，來合理組織方法，從不同水平和不同側面闡明和解決一個問題。③采用干預手段如基因的knock-in,knock-down,knock-out，或應用各種工具藥、抗體等影響分子及功能。一、研究方法的類型和選用原則1、能夠完成研究目標無疑，選擇的研究方法應當能夠解決研究目標中提出的問題。例如，研究目標是探索A因子對腦缺血的調節(jié)作用，選擇的方法就應當能夠檢測A因子量及活性的改變；還應選擇不同的腦缺血動物模型；這些方法要滿足各個具體實施階段和觀察指標的要求。一、研究方法的類型和選用原則2、能夠從幾個角度說明一個問題單一的方法往往不能揭示問題的全貌，因而現代生物醫(yī)學研究中常常需要幾種類型方法的組合，從不同側面闡明問題的特征。A.胚胎干細胞水平進行分子操作誘導型CaMKII基因敲除分子功能的研究策略B.海馬腦片電生理試驗長時程增強C.學習記憶行為學試驗Morris水迷宮一、研究方法的類型和選用原則3、根據現有條件研究者常常困擾于研究手段的不夠，解決的辦法可以是利用其他研究設施，也可以充分利用本單位現有研究設施和條件，顯然，后者更可行。在確定研究目標時就應當充分考慮結合現有研究條件，盡可能充分利用本單位的特色和優(yōu)勢來設計研究方案。二、幾類發(fā)展較快的研究方法1、功能可視化2、高通量篩選3、生物信息學二、幾類發(fā)展較快的研究方法1、功能可視化細胞水平：

①Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Cl－等離子，cAMP、細胞內pH、膜電位、鈣調蛋白、PKC等的變化②熒光蛋白基因標記目的蛋白整體水平：化學發(fā)光、fMRI、PET等PhotographofthejellyfishAequorea

victoriawhichproducesthegreenfluorescentprotein

(GFP).(PhotographcourtesyofClaudiaMillsattheFridayHarborResearchLaboratories,WA,USA.)KainSRGreenfluorescentprotein(GFP):applicationsincell-basedassaysfordrugdiscovery.DrugDiscovToday1999;4(7):304-312.熒光信號檢測腫瘤或器官腫瘤不同器官磁共振（MRI）檢測腦病理變化及腫瘤分子變化（活體顯微鏡）正電子發(fā)射斷層掃描（PET）檢測分子變化功能磁共振（fMRI）檢測功能變化2、高通量篩選

（high-throughputscreening,HTS）以玻璃片、膜片或培養(yǎng)板為載體，用高密度、微量自動化加樣的方法，實現短時間內分析大量樣本，這就是最近發(fā)展起來的高通量篩選方法。二、幾類發(fā)展較快的研究方法DNA、蛋白等芯片技術一次可測定數千至上萬個點。細胞水平高通量篩選方法通常一次可以測定384～1536個點，現在還有3456個點的超高通量篩選方法（ultra-high-throughputscreening,UHTS）。二、幾類發(fā)展較快的研究方法Computer-generatedvisualizationoftheUHTSSconfiguration(AuroraBiosciences,SanDiego,CA,USA).Thesystemisdesignedtointegrateaworkingcompoundsolutionstore,96-or384-wellplatereplicatingsystem,componentsforautomateddistributionofcompoundsandassayreagentsintohighdensity3456-wellNanoWellassayplates(AuroraBiosciences),automatedincubatorsandahigh-performancefluorescenceplate-reader.TheHitProfilingRobotprovidesautomatedre-formattingofselectedcompoundsforre-testing.（1）高通量篩選的基本條件①基因/蛋白庫，篩選疾病基因或其表達的蛋白，需要有完備的基因或蛋白庫。②檢測指標，需要將檢測指標轉化為有簡便、靈敏、穩(wěn)定的客觀檢測信號，如熒光、化學發(fā)光、放射性核素等。③檢測儀器，制作快速檢測微量樣本的儀器，保證高通量篩選的信息能夠快速準確地讀出。二、幾類發(fā)展較快的研究方法④自動化取樣和加樣機器人，一次加樣上千個微量樣本，人工無法完成，因此研制自動化儀器同樣是必不可少的條件。⑤計算機數據分析系統(tǒng)，針對短時間獲得的龐大的實驗數據，必須有相應的計算機硬件和軟件的支持。⑥化合物庫，高通量篩選藥物還需要有數十萬至上百萬個化合物儲備。二、幾類發(fā)展較快的研究方法高通量篩選涉及到醫(yī)學及其各個分支、分子生物學、化學、光學、自動化儀器、計算機等眾多學科。二、幾類發(fā)展較快的研究方法（2）用于高通量篩選的生物材料

一類是cDNA、寡核苷酸、mRNA、抗體、酶、蛋白等生物大分子，將生物大分子以高密度微矩陣方式排列于玻璃板或膜片上，與生物樣本反應，然后檢測觀察指標的變化，常稱為芯片（chip）技術。一類是細胞。以細胞為材料的研究方法，采取預先制備目的基因或報告基因的轉染細胞株，然后觀察目的基因或報告基因表達變化。二、幾類發(fā)展較快的研究方法（3）研究方法類型預先將不同樣本（不同處理方式、不同處理時間、不同個體等）排列在載體上，然后與相同的探針反應，檢測指標變化。預先將不同探針排列在載體上，然后與相同的生物樣本反應，檢測指標變化。二、幾類發(fā)展較快的研究方法DNA芯片（基因芯片）研究結果基因表達譜研究AD病人基因組功能異常紅色：表達增加藍色：表達減少蛋白芯片研究方法示意圖2D蛋白電泳示意圖2D蛋白電泳顯示蛋白表達譜及其結果解析需要指出的是，高通量技術的采用并不排除傳統(tǒng)研究方法，而是互相補充。高通量技術快速檢出相關的靶分子，再以精細的方法深入研究靶分子變化特點，或在整體或離體水平觀察其功能變化特點。在傳統(tǒng)研究方法中引入高通量技術，將大大促進傳統(tǒng)技術的改進和研究效率的提高。二、幾類發(fā)展較快的研究方法3、生物信息學（Bioinformatics）“insilico”研究近年來提出一類新的研究技術，即insilico研究技術，字面是解釋是“硅片上的研究”，即利用計算機數據綜合分析方法進行生物學研究。該技術指的是利用生物信息學技術將獲得的實驗數據與生物信息數據庫進行比對、分析和評定，獲取研究結論的研究技術，與invivo、invitro、insitu、exvivo等技術相平行。insi