(高清版)GBT 42115-2022 牛惡性卡他熱診斷技術(shù)

牛惡性卡他熱診斷技術(shù)2022-12-30發(fā)布2023-07-01實施國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC181)歸口。本文件起草單位：中國動物疫病預(yù)防控制中心、青海省動物疫病預(yù)防控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心、江西省動物疫病預(yù)防控制中心、西藏自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團動物疫病預(yù)防控制中心、黑龍江省動物疫病預(yù)防與控制中心。顧小雪、蘇曉慧、美熱木古麗·巴依待拉提、任娟、薛文、秦菊、努爾麥麥提·阿穆提、沙娜瓦爾·塔西、Ⅱ牛惡性卡他熱(BovineMalignantCatarrhalFever,BMCF)是由皰疹病毒科丙型皰疹病毒亞科的惡性卡他熱病毒(MalignantCatarrhalFeverVirus,MCFV)引起，以高熱、雙側(cè)角膜混濁、口鼻部壞死、口腔黏膜潰瘍、高死亡率為特征的急性、高度致死性傳染病。該病主要發(fā)生于非洲，也見于歐洲、亞洲以及動物疫病。在與反芻動物相關(guān)的至少10余種皰疹病毒中，能引發(fā)惡性卡他熱且具有致病性的病原分別是綿羊皰疹病毒2型(OvineHerpesvirus2,OvHV-2)和猬羚皰疹病毒1型(AlcelaphineHerpesvirus1,AIHV-1),事實上幾乎所有的牛惡性卡他熱臨床病例，都是由綿羊和牛羚所攜帶的病毒感染造成的。在沒有牛羚等野生動物的地區(qū)，家養(yǎng)的綿羊也能感染本病，且多為不表現(xiàn)臨床癥狀的隱性感染，這成為牛的主要感染來源?；疾∨５闹饕卣鳛槎唐诟邿?，口、鼻和眼睛的黏膜出現(xiàn)高度炎癥，甚至有出血和潰瘍，早期可見神經(jīng)癥狀，急性致死率非常高。牛惡性卡他熱的臨床癥狀易與牛病毒性腹瀉/黏膜病、口性腦炎臨床癥狀較為相似，需要做實驗室鑒別診斷。本文件參考了《陸生動物診斷試劑和疫苗使用手冊》(OIE)的有關(guān)內(nèi)容，技術(shù)方法與OIE推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法一致。其中病原分離方法適用于從活體動物腫脹的體表淋巴結(jié)、外周血液中以及從死亡動物的脾臟、腎臟或肝臟中分離MCFV;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)適用于檢測MCFV核酸，可用于對前病毒DNA的檢測；間接免疫熒光抗體試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)適用于檢測血清樣品中的MCFV抗體，可用于實驗室診斷、流1牛惡性卡他熱診斷技術(shù)1范圍本文件規(guī)定了牛惡性卡他熱的臨床診斷、病理診斷和綜合判定的技術(shù)要求，描述了病原學(xué)和血清學(xué)檢測方法。本文件適用于牛惡性卡他熱的臨床診斷、實驗室檢測、流行病學(xué)調(diào)查以及檢驗檢疫。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4臨床診斷4.1流行病學(xué)4.1.1牛惡性卡他熱常發(fā)生于水牛、奶牛、黃牛等牛屬反芻動物。在所有易感動物中黃牛和水牛易感性強，尤以1歲～4歲的青壯年牛易發(fā)病，老年牛發(fā)病較少。少數(shù)牛發(fā)病后呈溫和型或隱性感染的情4.1.2牛羚、角馬、羚羊等野生動物以及吸血昆蟲是本病的主要傳染源；在沒有牛羚等野生動物的地區(qū)，隱性感染的綿羊是本病的主要感染來源，發(fā)病牛常有與綿羊接觸的歷史，如同群放牧或者同欄飼養(yǎng)等。4.1.3牛惡性卡他熱病毒主要存在于病牛的血液、腦、脾、淋巴結(jié)等組織中，可通過吸血昆蟲機械性傳播；病毒也可以通過胎盤感染。潛伏期一般為10d～34d。4.2臨床癥狀頭眼型為最常見的病型，死亡率較高。病初體溫升高至40℃以上，食欲和反芻減少，頭部皮膚發(fā)熱。常在發(fā)病的第2天出現(xiàn)眼、口、鼻黏膜癥狀，雙眼結(jié)膜劇烈發(fā)炎，流出黃褐色膿性及纖維素性分泌物；眼瞼腫脹，角膜混濁，嚴(yán)重的表面形成潰瘍，甚至引起角膜穿孔。病程多為1周～2周，隨著病程發(fā)2牛突然發(fā)病，體溫升高到41℃~42℃,精神沉郁，食欲和反芻減少或者停止，喜飲水，鼻鏡干熱，呼該型較少見，除體溫升高等一般臨床癥狀外，消化道癥狀較為明顯。初便秘，后腹瀉，糞便中混有血液和脫落的壞死組織，腥臭。排尿次數(shù)增多，尿呈酸性，混濁，有時混有血液。眼有輕度的結(jié)膜炎。除了具有4.2.1的癥狀外，頰部、背部、乳房等部位的皮膚出現(xiàn)丘疹、水皰和龜裂壞死，形成痂皮等變化，并有斑狀脫毛區(qū)，角基部、會陰部、蹄冠周圍和趾間也會出現(xiàn)類似癥狀。5病理診斷5.1頭眼型有類似于白喉的病理變化，表現(xiàn)為咽部黏膜上皮細胞壞死，并逐漸擴大融合，同時可見局部黏膜血管擴張充血，大量纖維蛋白滲出與壞死細胞、白細胞和細菌凝結(jié)在一起，覆蓋在破壞的黏膜表面出現(xiàn)灰白色假膜，假膜形成處及周圍組織呈輕度充血腫脹。鼻骨、篩骨有壞死性變化。上皮下淋巴浸潤，全身性淋巴增殖和壞死，出現(xiàn)廣泛性血管炎。腎臟和肝臟等部位的血管出現(xiàn)淋巴細胞或者單核細胞浸潤。5.2最急性型胃腸道有出血點及潰瘍點，肝臟和腎臟有不同程度的腫大和出血?？谇?、皺胃和小腸的黏膜呈彌漫性出血，有的可見散在的點狀出血、潰瘍和糜爛，腸內(nèi)容物呈水樣，常混有血液。及相應(yīng)炎癥病理變化。注：皮膚型牛惡性卡他熱病理變化較輕。6病原學(xué)方法6.1基本要求除特殊說明外，本文件所有操作程序均應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。6.2病原分離與鑒定除特殊說明外，本文件使用的化學(xué)試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682標(biāo)準(zhǔn)的二級水。36.2.1.1商品化的白細胞提取試劑盒。6.2.1.2細胞生長液：按附錄A中的A.1描述的方法配制。6.2.1.6青霉素、鏈霉素(雙抗)液：按A.4描述的方法配制。6.2.1.7pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS):按A.5描述的方法配制。6.2.1.8牛甲狀腺細胞：按照附錄B給出的方法制備。6.2.1.12抗凝真空采血管。6.2.2.1二氧化碳培養(yǎng)箱。6.2.2.3低溫冰箱(-20℃)。6.2.2.4倒置生物顯微鏡。6.2.2.5二級生物安全柜。6.2.2.6超凈工作臺。6.2.2.7通用離心機。無菌采集表現(xiàn)出4.2描述的臨床癥狀，剖檢出現(xiàn)第5章描述的病理變化的病牛的抗凝外周血或新外周血液樣品按照商品化的白細胞提取試劑盒說明書提取白細胞，用細胞生長液制成白細胞懸液。將白細胞懸液加入聚四氟乙烯袋中，37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)10d～12d。牛甲狀腺單層細胞用細胞維持液洗2次，加入2mL～5mL6.2.4.1.1中制備的白細胞懸液，再加入細胞培養(yǎng)液，37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。在加入新維持液前先以pH7.2磷酸鹽緩沖液洗一次，除去紅細胞及沒有貼壁的細胞，每3d換液一次，連續(xù)培養(yǎng)約7d～21d并觀察細胞病變。初代培養(yǎng)以形成多核巨細胞為主(多在接種后3d～14d內(nèi)出現(xiàn))。組織學(xué)檢查，可見到嗜酸性核內(nèi)包涵體。隨傳代次數(shù)的增加，細胞病變的出現(xiàn)速度及程度逐4漸加快加劇，游離病毒量也逐漸增多。觀察期間應(yīng)根據(jù)細胞生長狀況換液和傳代。將淋巴結(jié)或脾臟剪成1mm～2mm的碎塊，充分磨碎后以維持液制成約10%的組織懸液，再經(jīng)維持液10倍稀釋后，自然靜置使組織塊下沉，取上清液置換長成單層的牛甲狀腺細胞培養(yǎng)液。37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，每3d換液一次，直至細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶底，用胰酶消化后分瓶培養(yǎng)并形成單層細胞后，記錄細胞病變情況。連續(xù)培養(yǎng)約7d～21d并觀察細胞病變。初代培養(yǎng)可以形成多核巨細胞為主(多在接種后3d~14d內(nèi)出現(xiàn))。組織學(xué)檢查，可見到嗜酸性核內(nèi)包涵體。隨傳代次數(shù)的增加，細胞病變的出現(xiàn)速度及程度逐漸加快加劇，游離病毒量也逐漸增多。觀察期間應(yīng)根據(jù)細胞生長狀況換液和傳代。惡性卡他熱病毒感染細胞典型細胞病變?yōu)榧毎诤闲纬珊习w，即多數(shù)細胞發(fā)生相互融合而成巨細胞。一般在接種后3d～14d內(nèi)，初代培養(yǎng)的細胞即可形成多核巨細胞。每個合胞體細胞中含有2個～20個細胞核，并且可見到嗜酸性核內(nèi)包涵體。隨傳代次數(shù)的增加，細胞病變的出現(xiàn)速度及程度逐中培養(yǎng)的細胞如出現(xiàn)細胞病變，應(yīng)按照附錄C描述的方法將其制備成細胞培養(yǎng)飛片，并采用間接免疫熒光抗體技術(shù)(按照附錄D給出的方法進行操作)。血液樣品或剖檢組織樣品接種后，出現(xiàn)6.2.4.3中描述的細胞病變，并且經(jīng)間接免疫熒光抗體染色，細胞培養(yǎng)飛片同陽性血清有熒光反應(yīng)，則判定為牛惡性卡他熱病毒分離陽性。剖檢組織樣品接種后，未出現(xiàn)6.2.4.3中描述的細胞病變，并且經(jīng)間接免疫熒光抗體染色，細胞培養(yǎng)飛片同陽性血清沒有熒光反應(yīng)，則判定為牛惡性卡他熱病毒分離陰性。6.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(半巢式)6.3.1試劑耗材6.3.1.2商品化單核細胞分離試劑。6.3.1.5無核酸酶水。6.3.1.71%瓊脂糖凝膠(按附錄E給出的方法進行配制)。6.3.1.85×TBE電泳緩沖液(按附錄E給出的方法進行配制)。56.3.2.3凝膠成像儀。6.3.2.4普通冰箱(2℃~8℃)。6.3.2.5普通冰箱(-20℃)。6.3.2.6分光光度計。引物及序列參見附錄F,引物用商品化的DEPC水配成100μmmol/L的儲存液和10μmol/L的工作液。陽性對照：含有目的基因片段的質(zhì)?；蛘卟《痉蛛x培養(yǎng)物。陰性對照：空載體質(zhì)粒或者正常組織細胞。使用商品化單核細胞分離液提取試劑，提取抗凝血中的外周血單核細胞。若為組織樣品，用無菌剪刀和鑷子剪取典型病變組織0.5g～1.0g,加入0.5mL～1mL0.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液，于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。按商品化DNA提取試劑盒的操作說明書，提取模板DNA,提取的DNA應(yīng)迅速進行PCR擴增，或置于—20℃冰箱備用。25μL反應(yīng)體系配制如下：——1μL的上游引物POL1(10μmol/L);——1μL的下游引物POL2(10μmol/L);——5μL的模板DNA;——5.5μL的無核酸酶水。取0.2mLPCR反應(yīng)管配制25μL反應(yīng)體系后，蓋緊蓋子并做好標(biāo)記，將其置于PCR擴增儀上，按如下程序擴增：95℃預(yù)變性15min,94℃變性60s,60℃退火60s,72℃延伸60s,25個循環(huán)，72℃終延伸10min。6.3.6.2.2第二輪PCR擴增(檢測OvHV-2型惡性卡他熱病毒核酸序列)25μL反應(yīng)體系配制如下：6——1μL的上游引物OMVPol2(10μmol/L);——1μL的下游引物POL2(10μmol/L);——2μL的模板DNA(第一輪PCR擴增產(chǎn)物);——8.5μL的無核酸酶水。取0.2mLPCR反應(yīng)管配制25μL反應(yīng)體系后，蓋緊蓋子并做好標(biāo)記，將其置于PCR擴增儀上，按如下程序擴增：95℃預(yù)變性15min,94℃變性60s,60℃退火60s,72℃延伸60s,30個循環(huán)，72℃終延伸10min。6.3.6.2.3第三輪PCR擴增(檢測AIHV-1型惡性卡他熱病毒核酸序列)25μL反應(yīng)體系配制如下：——1μL的上游引物AlHVPol2(10μmol/L);——1μL的下游引物POL2(10μmol/L);——2μL的模板DNA(第一輪PCR擴增產(chǎn)物);—8.5μL的滅菌雙蒸水。取0.2mLPCR反應(yīng)管配制25μL反應(yīng)體系后，蓋緊蓋子并做好標(biāo)記，將其置于PCR擴增儀上，按如下程序擴增：95℃預(yù)變性15min,94℃變性60s,60℃退火60s,72℃延伸60s,30個循環(huán)，72℃終延伸10min6.3.7擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測將PCR擴增產(chǎn)物和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，100V～120V恒壓電泳20min～40min,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并做好記錄。陽性對照的第一輪PCR產(chǎn)物電泳后在約388bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，第二輪PCR產(chǎn)物電泳后在約173bp的位置上出現(xiàn)特異性條帶，陰性對照PCR產(chǎn)物電泳后沒有條帶，試驗結(jié)果成立；否在試驗結(jié)果成立的前提下，如果使用OvHV-2引物，第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在約173bp的位置出現(xiàn)特異性條帶，則判該樣品中含有綿羊皰疹病毒2型(OvHV-2型)惡性卡他熱病毒核酸；如果使用AlHV-1引物，第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在約173bp的位置出現(xiàn)特異性條帶，則判該樣品中含有猬羚皰疹病毒1型(AlHV-1型)惡性卡他熱病毒核酸。為了進一步驗證檢測結(jié)果，可將PCR產(chǎn)物回收純化后進行測序。如果測序結(jié)果與附錄F中或與GenBank中綿羊皰疹病毒2型(OvHV-2型)惡性卡他熱病毒基因序列一致，則判該樣品中含有OvHV-2型惡性卡他熱病毒；如果測序結(jié)果與附錄F中或與GenBank中猾羚皰疹病毒1型(AlHV-1型)惡性卡他熱病毒基因序列一致，則判該樣品中含有AlHV-1型惡性卡他熱病毒。77血清學(xué)診斷采用夾心ELISA方法檢測血清或血漿樣品中MCFV抗體：預(yù)包被高純度重組MCFV的POL抗原，待檢血清中的抗MCFV抗體與包被抗原反應(yīng)，再與酶標(biāo)M酶標(biāo)抗原復(fù)合物，加底物(TMB)顯色，在酶標(biāo)儀上測定光密度體的存在。7.2試劑耗材7.2.996孔酶標(biāo)板。7.3儀器設(shè)備7.3.3洗板機。在包被MCFV重組抗原的酶標(biāo)板中分別加入陰性對照血清、陽性對照血清，每孔各50μL。在每個待測樣品孔中加入稀釋后的樣品50μL。棄去酶標(biāo)板中液體，用工作濃度洗液洗板5次。7.4.5第2次洗板按7.4.3方法洗板。8每孔中依次加入50μL底物溶液A液與50μL底物溶液B液，37℃下避光溫育15min。7.4.7反應(yīng)終止每一孔中加入50μL終止液。在酶標(biāo)儀上讀取每孔的450nm的吸光度，并讀取OD值。7.5試驗結(jié)果判定7.5.1試驗成立條件陽性對照OD值大于或等于1.0,并且陰性對照OD值小于0.2。臨界值：臨界值=陰性對照孔平均OD值+0.15;陽性判定：血清樣品OD值≥臨界值，判定為S-ELISA檢測陽性，表述為檢出牛惡性卡他熱血清抗體；陰性判定：血清樣品抑制率<臨界值，判定為S-ELISA檢測陰性，表述為未檢出牛惡性卡他熱血清抗體。8綜合判定8.1表現(xiàn)出4.2描述的臨床癥狀，剖檢出現(xiàn)第5章描述的病理變化的病牛，可初步判為牛惡性卡他熱可疑病例。8.2可疑病例并且6.2.4.4、6.3.7、7.5任何一項陽性者，可判為牛惡性卡他熱陽性確證病例9(規(guī)范性)細胞培養(yǎng)液的制備A.1細胞生長液900mL的DMEM營養(yǎng)液加100mL的胎牛血清混合，配制成1000mL的溶液，加入青霉素至終濃度100IU/mL,鏈霉素至終質(zhì)量濃度100μg/mL,充分混勻，過濾除菌后4℃儲存?zhèn)溆谩.2細胞維持液980mL的DMEM營養(yǎng)液加20mL的胎牛血清混合，配制成1000mL的溶液，加入青霉素至終濃度100IU/mL,鏈霉素至終質(zhì)量濃度100μg/mL,充分混勻，過濾除菌后4℃儲存?zhèn)溆?。A.3細胞消化液A.3.10.25%胰蛋白酶溶液的配制稱取250mg胰蛋白酶粉末，加入少許D-Hank’s,將胰蛋白酶粉末調(diào)成糊狀，再補足D-Hank’s至100mL,磁力攪拌混勻，使其完全溶解，放置室溫4h或4℃冰箱保存過夜。稱取200mg的EDTA·2Na,加D-Hank’s至1L,加入酚紅15mg,用碳酸氫鈉或鹽酸調(diào)pH至7.2。高壓消毒滅菌(6.9×103Pa,121℃,15min),分裝小瓶，于4℃保存?zhèn)溆?。?.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶1:1等量混合。A.4青霉素、鏈霉素(雙抗)液1g鏈霉素(硫酸鹽)溶解在10mLHank’s液，再用8mL鏈霉素(硫酸鹽)溶液溶解800KIU的青霉素粉，即配成含為100mg/mL鏈霉素和100KIU/mL青霉素的雙抗母液。使用時，在100mL培養(yǎng)基內(nèi)加0.1mL母液，則培養(yǎng)基內(nèi)鏈霉素質(zhì)量濃度為0.1mg/mL,青霉素濃度為100IU/mL。A.5pH7.2磷酸鹽緩沖液配制pH7.2磷酸鹽緩沖液所需試劑如下：——8g的氯化鈉(NaCl);—0.2g的氯化鉀(KCl);—1.44g的磷酸氫二鈉(Na?HPO?);—0.24g的磷酸二氫鉀(KH?PO?)。試劑加水溶解至1L,調(diào)整pH為7.2,然后高壓滅菌，室溫保存。(規(guī)范性)牛甲狀腺細胞制備及傳代B.1牛甲狀腺原代細胞的制備B.1.1樣品處理無菌采取胎牛甲狀腺，用D-Hank’s洗3次，剪成1mm3~2mm3的小塊，加入少量的細胞生長用3倍～5倍體積含0.1%～0.3%μg/mL的膠原酶組DMEM消化，37℃孵育4h,期間可振蕩數(shù)次。B.1.3過濾洗滌消化后的細胞懸液經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過濾后，收集消化液。消化液1000r/min離心10min,棄上B.1.4培養(yǎng)細胞沉淀用細胞生長液懸浮，調(diào)整細胞濃度至0.5×10?個細胞/mL,37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24h,棄去未貼壁細胞，換細胞生長液。此時已貼壁細胞為原代牛甲狀腺細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞長成連續(xù)單層細胞。B.2牛甲狀腺細胞的傳代將已長成連續(xù)單層的原代細胞用無血清DMEM洗2次，用細胞消化液消化后加入細胞生長液重懸細胞。細胞懸液1000r/min離心10min,用細胞生長液重浮細胞，調(diào)整細胞濃度至0.5×10?個/mL,分瓶培養(yǎng)。(規(guī)范性)細胞培養(yǎng)飛片的制備病毒接種細胞出現(xiàn)病變或確知細胞內(nèi)含有豐富的病毒抗原后，用胰酶消化細胞，用PBS洗滌3次，用適量PBS懸浮細胞，將細胞懸液滴于玻片孔中。同時消化未感染病毒的同批細胞，滴加同一玻片另一孔內(nèi)，作為正常細胞對照。孔內(nèi)滴加的細胞以細胞鋪開、不重疊為宜。室溫干燥后，冷丙酮(規(guī)范性)間接免疫熒光操作步驟D.1試劑耗材D.1.1固定液：稱取6.5g的磷酸氫二鈉及4.0g的磷酸二氫鈉，加水溶解，加入100mL甲醛(40%),加水定容至1L,調(diào)整pH值為7.4。D.1.3封閉液：牛血清白蛋白(BSA)粉末1g,加入PBST溶液定容至100mL。D.1.6牛惡性卡他熱陰性血清。D.1.8蓋玻片。D.2儀器設(shè)備熒光顯微鏡。D.3操作步驟D.3.2用PBST稀釋液洗3次，每次5min,室溫干燥。D.3.3將適當(dāng)稀釋的牛惡性卡他熱陽性血清、陰性血清分別滴于細胞培養(yǎng)飛片上，置濕盒內(nèi)，37℃孵育30min～45min。D.3.4用PBST稀釋液洗3次，每次5min,室溫干燥。D.3.5取適當(dāng)稀釋的熒光抗體，滴加于細胞培養(yǎng)飛片上，37℃孵育30min～45min。D.3.6用PBST稀釋液洗3次，每次5min,室溫干燥。D.4結(jié)果判定D.4.1試驗成立條件陰性血清與正常細胞和病毒感染細胞反應(yīng)均無熒光，陽性血清與正常細胞反應(yīng)無熒光。D.4.2結(jié)果判定細胞培養(yǎng)飛片與陽性血清熒光反應(yīng)，同陰性血清無熒光反應(yīng)，判為細胞培養(yǎng)飛片為陽性。(規(guī)范性)PCR試驗用溶液的配制E.15×TBE電泳緩沖液稱取54g的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、2.9mg的EDTA及27.5g的硼酸，加入滅菌雙蒸水溶解，定容至1L,用5mol/L的鹽酸調(diào)pH至8.0。E.21×TBE電泳緩沖液100mL電泳緩沖液(5×)和400mL滅菌雙蒸水混合。E.31%瓊脂糖凝膠稱取2g的瓊脂糖(電泳級),量取40mL的TBE電泳緩沖液(5×),加滅菌雙蒸水至200mL,微波爐中完全融化。(資料性)PCR方法引物序列和特異性片段PCR方法引物序列見表F.1。