試驗(yàn)六1、小鼠采精方法的研究

實(shí)驗(yàn)六、小鼠采精方法中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINE2005年4月第15卷第2期April,2005Vol.15No.2鄭新民,李聚學(xué),魏雁,喬憲鳳,周荊榮(湖北省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所,武漢430072小鼠是世界上研究最為詳盡的哺乳類動(dòng)物[1]。但是目前人們?nèi)匀皇峭ㄟ^(guò)手術(shù)法從小鼠附睪中獲取精子,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)小鼠非手術(shù)法采精的報(bào)道。手術(shù)法采精為眾多的科學(xué)研究帶來(lái)了不便:(1)手術(shù)法采精必須將雄鼠處死,分離其附睪和輸精管來(lái)獲取精子,過(guò)程繁瑣,費(fèi)時(shí)費(fèi)工,且造成不必要的經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)[2]。另外,從附睪中獲取的精子由于缺少副性腺中的諸多有益成分,精子品質(zhì)難以保證[3];(2)不利于小鼠生殖生理的研究,在醫(yī)學(xué)上,人們都是通過(guò)“殺雞取卵”式地宰殺大量的雄鼠來(lái)獲取精子進(jìn)行科研分析[4-6],不但造成了很大的經(jīng)濟(jì)浪費(fèi),而且增加了實(shí)驗(yàn)的誤差和難度;(3)不利于某些動(dòng)物模型的建立,例如,由于小鼠精子獲取繁瑣,人工授精技術(shù)不易建立,精子載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)尚無(wú)理想的動(dòng)物模型,這極不利于該項(xiàng)研究的開(kāi)展[7]。由此可見(jiàn),建立一種方便快速的小鼠非手術(shù)法采精技術(shù)對(duì)解決小鼠手術(shù)法采精中存在的問(wèn)題、小鼠生殖生理的研究和建立某些小鼠動(dòng)物模型都是很有意義的。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明小白鼠雄鼠,購(gòu)自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院。合格證號(hào)為:SYXK(鄂)20035853。1.2小鼠假陰道抽吸器的制備小鼠假陰道的制作:取一段長(zhǎng)約2cm,內(nèi)徑8mm的軟質(zhì)透明塑料管,在其內(nèi)側(cè)套上一層厚度約0.1mm的膠膜,膠膜要求透明且有良好的彈性。在塑料管中部鉆一直徑為2mm的小孔,將一外徑與小孔相當(dāng)?shù)挠操|(zhì)插管插入小孔中,深度與塑料管管壁厚度相當(dāng),小孔周圍用強(qiáng)力膠水密封,向小管中輕輕吹入空氣即可將塑料管內(nèi)側(cè)膠膜充起。將制好的小鼠假陰道與膠頭吸管相連,小鼠假陰道抽吸器即制作完畢。1.3電刺激采精儀的制備電刺激采精儀由電刺激發(fā)生器和直腸探子兩部分組成。電刺激發(fā)生器由交流變壓器、電流表、電壓調(diào)節(jié)器,變頻器,電源開(kāi)關(guān)等部件組成。直腸探子可用小塑料管自行制成,探子上裝有電極,電極與電刺激發(fā)生器插座用電線相連。電刺激采精儀的特點(diǎn):電壓連續(xù)可調(diào),范圍為0~20V;頻率選擇范圍為0~50Hz;通電間歇時(shí)間可根據(jù)不同情況自行選擇。1.4小鼠采精實(shí)驗(yàn)1.4.1小鼠保定:利用筒式法保定小鼠,小鼠保定筒可用與小鼠體軀相似的塑料筒制成,塑料筒兩端鉆有插孔,一端鋸有缺口。待小鼠鉆入筒內(nèi)后,迅速將鐵釘插入插孔中,限制小鼠伸縮,即可將小鼠保定。將保定好的小鼠在筒內(nèi)旋轉(zhuǎn),使其生殖器暴露在缺口中,以利精液收集。1.4.2小鼠徒手法采精:小鼠保定后,用75%的酒精將其生殖器消毒,待酒精揮發(fā)后,用手指輕輕按摩小鼠生殖器。1.4.3小鼠假陰道抽吸法采精:小鼠假陰道消毒后,用凡士林將其內(nèi)側(cè)膠膜潤(rùn)滑,從插管中輕輕吹入空氣,待內(nèi)側(cè)膠膜充起后,迅速將插孔堵住,以防氣體外逸。用手輕輕按摩小鼠生殖器,待小鼠陰莖勃起后,將陰莖迅速吸入37℃預(yù)熱后的假陰道內(nèi),然后用手指擠壓吸管膠頭,小鼠陰莖便在管腔負(fù)壓的作用下做活塞運(yùn)動(dòng),這時(shí)可向假陰道內(nèi)不斷吹入氣體,以增加膠膜對(duì)小鼠陰莖的壓力。抽吸頻率可由慢至快,直至小鼠射精。1.4.4小鼠電刺激采精:直腸探子用75%的酒精消毒后,用石蠟油或凡士林將其潤(rùn)滑,輕輕地插入小鼠直腸中,深度約2.5~3cm。如在插入過(guò)程中遇有阻力,則表明小鼠糞便尚未排出,這時(shí)將探子退出,用手指輕揉小鼠下腹部,促使小鼠排便,然后再將直腸探子插入。打開(kāi)電刺激采精儀,以頻率為20Hz,起點(diǎn)電壓為2V,占空比為5P5s秒通電刺激,刺激30s后,電壓上升1~2V,重復(fù)以上步驟,直到小鼠生殖器充血勃起而向外突出,這時(shí)應(yīng)作好集精準(zhǔn)備。1.4.5精液的收集:小鼠精液剛射出時(shí)為白色粘稠液體,但會(huì)在短時(shí)間內(nèi)凝固成白色固體,因此應(yīng)迅速收集精液到有稀釋液的離心管中。如伴有淡黃色液體流出,則為尿液,應(yīng)用滅菌紗布迅速擦干,以免污染精液。另外,在射精過(guò)程中,有透明液體伴隨精液流出,可用移液槍將其收集。1.5總精子量和精子活率的測(cè)定反復(fù)吹吸精液,待精子在精液稀釋液中充分游離后,用血細(xì)胞記數(shù)板測(cè)定精子的密度和活率,然后根據(jù)稀釋液的體積和所測(cè)定的精子密度計(jì)算總精子數(shù)。表2射精不同階段精子量和活率的比較Tab.2Comparisonsofspermatozoaquantityandmotilityatdifferentejaculationstages項(xiàng)目1234ItemFirstSecondThirdFourth精子量(億)Semenquantity0.051.20.80.15活率(%)40828383Motility%從表2可以看出,第一階段射出的精子量(0.05億)很小,活率很低(40%)。精子主要富集在第二(1.2億)和第三階段(0.8億),且所獲得的精子活率較高(分別為82%和83%)。第四階段獲得的精子量較少(0.15億),但活率較高(83%)。2.3小鼠重復(fù)采精效果用假陰道抽吸法和電刺激法采精后,間隔5d,用同樣的方法重復(fù)采精,結(jié)果見(jiàn)表3。表3假陰道抽吸法重復(fù)采精結(jié)果Tab.3Resultsofrepeatedcollectionofsemenbyartificalvaginapump重復(fù)次數(shù)采精成功率(%)精子量(億)活率(%)FrequencyRate%SemenquantityMotility%(inhundredmillion)第一次采精(First)77a2.3b80c第二次采精(Second)73a2.0b81c注:同一豎欄內(nèi)相同標(biāo)注者表示差異不顯著(Thesamesuperscriptsinaverticalcolumnshownodifference)表4電刺激法重復(fù)采精結(jié)果Tab.4Resultsofrepeatedsemencollectionbyelectroejaculation重復(fù)采精采精成功率(%)精子量(億)活率(%)FrequencySuccessrate%SemenquantityMotility%第一次采精(First)70a2.0b82c第二次采精(Second)75a2.1b83c注:同一豎欄內(nèi)相同標(biāo)注者表示差異不顯著(Thesamesuperscriptsinaverticalcolumnshownodifference)從表3和表4可以看出,與首次采精相比,假陰道抽吸法和電刺激法對(duì)小鼠進(jìn)行重復(fù)采精的成功率(73%和77%,75%和70%)、平均總精子量(2.0億和2.3億,2.1億和2.0億)和精子活率(81%和80%,83%和82%)均差異不顯著。3討論(1)小鼠個(gè)體小,其生殖器也較小,直接用手指進(jìn)行徒手按摩很難控制力度,不能對(duì)小鼠陰莖進(jìn)行有效的刺激,且易導(dǎo)致小鼠生殖器官的感染,對(duì)8只小鼠用徒手法進(jìn)行了采精嘗試,無(wú)一例采出精子,故我們認(rèn)為徒手法采精不適合于小鼠。小鼠假陰道抽吸采精器則能很好的解決這一問(wèn)題,它能較好地控制假陰道內(nèi)壁對(duì)小鼠陰莖的壓力,其刺激頻率可以通過(guò)控制吸管抽吸頻率得以調(diào)節(jié),采精成功率可達(dá)77%。電刺激采精是通過(guò)脈沖電流刺激生殖器引起動(dòng)物性興奮并射精來(lái)達(dá)到采精目的[8]。該法在牛、狐貍、鹿、海貍鼠和多種野生動(dòng)物上已成功地應(yīng)用[8-11]。我們將其應(yīng)用于小鼠,獲得了70%的采精成功率。長(zhǎng)期以來(lái),人們已習(xí)慣于手術(shù)法從小鼠附睪中獲取精子,而非手術(shù)采精則被忽視。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻表明:小鼠非手術(shù)法采精是完全可行的。(2)與其他動(dòng)物不同,小鼠精液在射出體外的瞬間即發(fā)生凝固現(xiàn)象,這與小鼠的特殊性腺凝固腺有關(guān)[12]。凝固腺分泌促精液凝固的蛋白成分,當(dāng)射出的精液在體外遇到空氣,小鼠精液便迅速發(fā)生凝固現(xiàn)象,精子主要附著在凝固物上。凝固物的作用是在剛交配的母鼠陰道中形成陰道栓,阻止精子外流。與豬等家畜相似,小鼠射精也分成多個(gè)階段,第一階段射出的精液精子含量少,且以死精居多,精子活率低[13]。小鼠精子主要富集在第二和第三階段,這兩階段射出的精液精子活率高(81%~82%),末尾射出的精液所含的精子較少。(3)小鼠重復(fù)采精實(shí)驗(yàn)表明,小鼠可在休息一段時(shí)間后重復(fù)采精,假陰道抽吸法和電刺激法對(duì)小鼠采精無(wú)明顯影響。假陰道抽吸器主要是根據(jù)小鼠自然交配的特點(diǎn)制作而成,對(duì)小鼠生殖器刺激小,不會(huì)對(duì)生殖器造成器質(zhì)性損傷。電刺激法在牛、狗熊、熊貓、小靈貓等