2024禽流感診斷技術(shù)

禽流感診斷技術(shù)目 錄范圍 3規(guī)性用件 3縮語(yǔ)定義 3臨診斷 4樣采、存運(yùn)輸 5病分與定 5血素集血素制（HA和HI）試驗(yàn) 6禽感毒RT-PCR驗(yàn) 7禽感毒時(shí)光RT-PCR驗(yàn) 8合定 9附錄A（規(guī)性試用溶和1%細(xì)的制 10附錄B（資性血特異凝和特性制因的理法 12附錄C（資性高性禽感毒IVPI測(cè)驗(yàn) 14附錄D（資性禽病毒RT-PCR驗(yàn)引物 16附錄E（資性）RT-PCR反液制 17附錄F（資性實(shí)光RT-PCR引探序反應(yīng)配方 181禽流感診斷技術(shù)范圍（（HA和RT-PCRRT-PCR本文件適用于禽流感（包括高致病性禽流感）的診斷、檢疫、檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等。（GB/T19489 實(shí)室 物安通要求NY/T765 下列縮略語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1禽流感avianinfluenza；AI由正黏病毒科ɑ流感病毒屬的病毒（A型流感病毒）引起的一種以禽類(lèi)為主的感染和/或疾病綜合征。3.2高致病性禽流感highlypathogenicavianinfluenza；HPAI由高致病性A型流感病毒，通常是由H5或者H7亞型，引起的以禽類(lèi)為主的急性傳染病。3.3血凝試驗(yàn)haemagglutination；HA利用流感病毒表面的血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白具有結(jié)合紅細(xì)胞表面受體并使紅細(xì)胞凝集的特性而開(kāi)展的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（haemagglutination，HA），可以用來(lái)檢測(cè)流感病毒的含量。3.4血凝抑制haemagglutinationinhibition；HI特異性抗體結(jié)合到流感病毒血凝素蛋白的抗原位點(diǎn)后能夠抑制流感病毒血凝素與紅細(xì)胞受體之間3.53靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)intravenouspathogenicityindex；IVPI一種判定流感病毒致病能力高低的方法。見(jiàn)附錄C。3.6反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)reversetranscription-polymerasechainreaction；RT-PCR一種用于放大擴(kuò)增特定的RNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。先用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過(guò)程。3.7實(shí)時(shí)熒光RT-PCRreal-timeRT-PCR利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程的一種擴(kuò)增核酸方法。3.8Ct/Cp值thresholdcycle/crossingpoint每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4.2.2出現(xiàn)4.2.1中的情況，初步判為低致病性禽流感臨床可疑病例，需要進(jìn)一步開(kāi)展鑒別診斷。出現(xiàn)4.2.2、4.2.3、4.3中的情況，初步判為高致病性禽流感臨床可疑病例，需要進(jìn)一步開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室診斷。4NY/T765/2～32～31.2mLA.1）2mL10g無(wú)菌采集禽類(lèi)的血液，每只約2mL，編號(hào)并填寫(xiě)相應(yīng)采樣單。待血液凝固，血清析出后，收集血清用于HI檢測(cè)。5.6樣品保存和運(yùn)輸24h44d(-70AIVHPAIVGB/T19489將棉拭子充分捻動(dòng)、擠干后棄去拭子；糞便、研碎的組織加樣品稀釋液充分研磨，配成10%(g/mL)的懸液。樣品液經(jīng)3000r/min離心10min，取上清作為接種或者核酸檢測(cè)材料。0.2mL/9d～11d(SPF℃孵化箱內(nèi)孵育，18h后每天上午和下午定點(diǎn)觀察雞胚死亡情況。無(wú)菌收取18h72hHA活性。若無(wú)HA活性，則收取尿囊液進(jìn)行盲傳，至少盲傳1代，若仍無(wú)HA活性，則認(rèn)為病毒分離陰性；若有HA活性說(shuō)明可能有正黏病毒科的流感病毒，可進(jìn)一步采用血凝素凝集和血凝素抑制（HA和HI）試驗(yàn)(見(jiàn)5第7IVPICRT-PCRRT-PCR9（HA）（HI）試驗(yàn)血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)方法適用于HA亞型的判定和抗體效價(jià)測(cè)定。(Alsevers)A.2。1%（V/V）A.3。pH7.2、0.01mol/LPBSA.4。HAHA96V0.025mLPBS。l0.025mL10.025mL20.025mL3211110.025mL12PBS0.025mLPBS。0.025mL1%（V/V）2040min25℃時(shí)）460min60o（100）HIHA44HAU）示例：1:256（288log2），4HAU=256/4=64（1∶64）；PBS6.3mL0.1mL1∶644HAU4HAU1∶641∶21∶31∶41∶5、1∶61∶70.025mLPBS0.025mL1%雞紅細(xì)0.025mL（20℃）40min460min4HAU，1∶44HAU1∶51∶61∶2134HAU。1～110.025mLPBS120.05mLPBS10.025mLB）1PBS0.025mL2210100.025mL111～110.025mL4HAU20）30min4℃60min。0.025mL1%（V/V）20℃）40min60min（126111∶4（22214HAUHI/HI1∶8（233log2）1∶16（244log2）HI≥1∶16（244log2）HI1∶8（233log2）H5RT-PCR適用于檢測(cè)禽組織、分泌物、排泄物、雞胚培養(yǎng)物等樣品中禽流感病毒核酸。8.2.1PCR擴(kuò)增儀及配套反應(yīng)管。8.2.2（12000r/min）。8.2.3II級(jí)生物安全柜。8.2.4（5、10、100、1000L）1.5mL離心管。8.2.5電泳儀。8.2.6電泳槽。8.2.7紫外凝膠成像儀。推薦的禽流感病毒RT-PCRD.1。RT-PCR反應(yīng)液，配方參見(jiàn)附錄E.1。無(wú)核酸酶水，配方參見(jiàn)附錄E.2。SPFRNA可選市售商品化RNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT-PCR取2.5μL（約250ng）RNART-PCRPCR：4545min；942min；94℃3052℃45、6845s，3568℃延伸8min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。7RT-PCR實(shí)時(shí)熒光RT-PCR適用于檢測(cè)禽組織、分泌物、排泄物、雞胚尿囊液等樣品中禽流感病毒核酸。PCR儀。9.2.2其余器材同8.2.2～8.2.4。推薦的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物探針序列參見(jiàn)附錄F.1?？蛇x市售商品化RNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT-PCRRT-PCR宜在專(zhuān)門(mén)的配液區(qū)配制實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。根據(jù)需要檢測(cè)的樣品數(shù)，按推薦的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)液配方,參見(jiàn)附錄F.2，配制反應(yīng)液，充分混勻后分裝，每個(gè)反應(yīng)管15μL。轉(zhuǎn)移反應(yīng)管至樣本制備區(qū)。加樣9.5.19.4RNA5μL(約500ng20μL，500r/min30。RT-PCRRT-PCR9.5.2RT-PCRnone。推薦的實(shí)時(shí)熒光RT-PCRF.3。綜合分析儀器讀取的各項(xiàng)數(shù)據(jù)及擴(kuò)增曲線，設(shè)定合理的閾值（Threshold）和基線（Baseline），使儀器顯示正確的結(jié)果。陰性對(duì)照檢測(cè)通道讀取數(shù)據(jù)無(wú)Ct/CpCt/Cp30。Ct/Cp30830＜Ct/Cp35Ct/CpCt/Cp35疑似臨床上出現(xiàn)4.2.2、4.2.3、4.3中的情況，初步判為高致病性禽流感臨床可疑病例，經(jīng)非參考實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，M基因的RT-PCR或?qū)崟r(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性，H5或H7亞型檢測(cè)陽(yáng)性，可判為高致病性禽流感疑似病例，M基因的RT-PCR或?qū)崟r(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性，H5或H7亞型檢測(cè)陰性，可判為低致病性禽流感病例。確診HAHIIVPI值大于IVPI1.2的H5或H7HA（OFFLU）9附錄A（）試驗(yàn)所用溶液和1紅細(xì)胞的配制A液：0.2ol/LaHOHO2.6g1000。B液：0.2mol/LNa2HPO4·7H2O53.6gNa2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）加蒸餾水溶解，最后定容至1000mL。0.01mol/LpH7.2（PBS）（A14，B液36NaCl8.51000121℃±2℃，15min2000（2（50（1000U/mL）（5mg/mL）。上述抗生素濃度宜用于組織和咽喉拭子，如果用作糞便和泄殖腔拭子的緩沖液，抗生素可提高5倍。（Alsevers）2.050.80.0550.420100pH6.1，69kPa15min41采集至少三只SPF雞或無(wú)禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH7.20.01mol/LPBS31000r/min10minPBS1%（V/V）1SPFpH7.20.01mol/LPBS31000r/minPBS2%5%PBS5min3PBS1%（V/V）醛化紅細(xì)胞懸液，置2～8℃保存?zhèn)溆?。pH7.2，0.01mol/LPBS25×PB2.74g0.79g100。1×PBS40mL25×PB8.5g1000。c）pH7.2。10PBS2～8211附錄B（資料性）血清非特異性凝集和非特異性抑制因子的處理方法）HA0.5mL0.025mL5030min，800×gmin～5min（HI1HAHI--取03mL0.15mL（8g/200g的P250胰酶溶解于5mL的0.01ol/，pH值7.0～7.2PBS?15630min0.9mL230mgKIO40.01mol/L，pH7.0～7.2PBS1周）15。0.9mL（1mL99mL0.01mol/L，pH值7.0～7.2的PBS中，混勻，過(guò)濾除菌，室溫保存），混合，室溫孵育15min。0.75mL410（RDE）處理法1（50μL）4體積RDE（200μL），3718h（）。5（2501.5%5630）。150%10RDE（50μL+500μL血清41hd)1000g離心10min，小心吸取上層上清，用于檢測(cè)。處理后的血清最終為10倍稀釋的血清。HI2～110.025mLPBS120.05mLPBS120.025mL2PBS0.025mL3孔，210100.025mL1112第1～11.025m4U（約2040in或4℃0i。0.025mL（2040min或4℃60min1∶10，14HAUHIHI1∶101∶10（1∶10）13附錄C（）高致病性禽流感病毒IVPI測(cè)定試驗(yàn)6周齡SPF雞，10只。1∶16（244log2）1∶100.110d。0123//1IVPIC.1C.1。表C.1 設(shè)致性感病致性驗(yàn)錄果臨床癥狀D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10分類(lèi)總計(jì)得分正常（a=0）10533210000240病雞（b=1）000000000000重病雞（c=2）05201110001020死亡（d=3）005778910101066198總計(jì)//////////100218注1：當(dāng)IVPI值大于1.2時(shí)，判定分離株為高致病性禽流感病毒（HPAIV）。注2：本試驗(yàn)中IVPI＝（0+0+20+198）/100＝2.18＞1.2，因此，本試驗(yàn)中的分離株為HPAIV。IVPIIVPI值計(jì)算參見(jiàn)公式（C.1）IVPI＝ Σa×0＋Σb×1＋Σc×2＋Σd×3 （C.1）T14式中：Σa——10d累計(jì)正常雞數(shù)；Σb——10d累計(jì)病雞數(shù)；Σc——10d累計(jì)重病雞數(shù)；Σd——10d累計(jì)死雞數(shù)；T——10d累計(jì)記錄10只雞的總次數(shù),即100。當(dāng)IVPI1.2(HPAI)當(dāng)IVPI1.2時(shí)，和H7HA15附錄D（）禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)用引物D.1禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)用引物采用普通RT-PCR方法開(kāi)展禽流感檢測(cè)，可根據(jù)檢測(cè)目的基因不同選擇參見(jiàn)表D.1中的引物。表D.1禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)可選擇的引物引物名稱(chēng)引物序列5′--3′長(zhǎng)度bp擴(kuò)增目的基因M-229UTTCTAACCGAGGTCGAAAC229MM-229LAAGCGTCTACGCTGCAGTCCH5-372UGGAATATGGTAACTGCAACACCA372H5H5-372LAACTGAGTGTTCATTTTGTCAATGH7-501UAATGCACARGGAGGAGGAACT501H7H7-501LTGAYGCCCCGAAGCTAAACCAH9-273UTGTGTCTTACGATGGGACAAGCA273H9H9-273LTTGACAAGAGGCCTTGGTCCTATN1-358UATTRAAATACAAYGGYATAATAAC358N1N1-358LGTCWCCGAAAACYCCACTGCAN2-377UGTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAG377N2N2-377LGAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCAN9-203UATAATGAAACAAACATCACCAA203N9N9-203LAGCATAGAACCTGCATTCATCT注：W=(AT)；Y=(CT)；R=(AG)。16附錄E（資料性）RT-PCR反應(yīng)液配制RT-PCR每個(gè)RT-PCR反應(yīng)體系包括的組分參見(jiàn)表E.2。表E.2RT-PCR反應(yīng)液配方組分1個(gè)檢測(cè)體系的加入量μL5×反應(yīng)緩沖液5.010mmol/LdNTP0.515mmol/L氯化鎂1.020pmol上游引物0.520pmol下游引物0.5AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)0.5TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5無(wú)核酶滅菌水14.0DEPC0.112h(121±2)℃高壓30min17附錄F（）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物探針序列及反應(yīng)液配方采用熒光RT-PCR方法開(kāi)展禽流感檢測(cè)，可根據(jù)檢測(cè)目的基因參見(jiàn)表F1提供的序列由公司合成引物和探針，純度為HPLC級(jí)，用RNase-Free滅菌水溶解并稀釋至終濃度10μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆?。表F.1禽流感病毒熒光RT-PCR試驗(yàn)可選擇的引物和探針引物和探針名稱(chēng)序列(5′-3′)M上游引物1GACCRATCCTGTCACCTCTGACM下游引物1AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTAM探針1FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1H5上游引物AGGGAGGATGGCAGGGAATGH5下游引物TCTTTGTCTGCAGCGTACCCACTH5探針FAM-ATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATG-BHQ1H7上游引物CTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCAH7下游引物AATTGCCGATTGAGTGCTTTTH7探針FAM-CAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCT-BHQ1N1上游引物AAGRTTTGAGTCTGTTGCTTGGTCN1下游引物CYCCATTGTCTGGACCAGAAATN1探針FAM-CAAGTGCTTGTCATGATGGCATCAGTTGGTT-BHQ1N6上游引物TGCAGGATGTTTGCTCTGAGTCN6下游引物CGAAATGGGCTCCTATCATGTATN6探