基因的重組與轉(zhuǎn)移課件

基因，啟動子，調(diào)控元件可以從基因組DNA克隆載體（包括質(zhì)粒，噬菌體，M13等）的純化DNA重組的基本策略1基因的重組與轉(zhuǎn)移外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第六章DNA的連接與轉(zhuǎn)化

2基因的重組與轉(zhuǎn)移3基因的重組與轉(zhuǎn)移一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。第一節(jié)DNA片段的體外連接4基因的重組與轉(zhuǎn)移兩段DNA的連接1.依靠粘性末端5基因的重組與轉(zhuǎn)移DNA片段與載體的連接2.依靠粘性末端6基因的重組與轉(zhuǎn)移7基因的重組與轉(zhuǎn)移ligasenick8基因的重組與轉(zhuǎn)移9基因的重組與轉(zhuǎn)移3粘性末端部分添平連接法10基因的重組與轉(zhuǎn)移脫磷酸化的目的就是防止載體自連11基因的重組與轉(zhuǎn)移此缺口將在大腸桿菌中被修復(fù)酶修補(bǔ)12基因的重組與轉(zhuǎn)移二、平齊末端（bluntend）的連接1.直接連接5’端與3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’13基因的重組與轉(zhuǎn)移平末端直接連接14基因的重組與轉(zhuǎn)移1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)15基因的重組與轉(zhuǎn)移④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點(diǎn)16基因的重組與轉(zhuǎn)移用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。5’P-GGAATTCC-OH3’

3’OH-CCTTAAGG-P5’EcoRIlinker：②linker的作用17基因的重組與轉(zhuǎn)移18基因的重組與轉(zhuǎn)移利用linker將平頭末端轉(zhuǎn)換成粘性末端19基因的重組與轉(zhuǎn)移20基因的重組與轉(zhuǎn)移④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：21基因的重組與轉(zhuǎn)移（3）DNA接頭(adapter)連接法1978年康奈爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5’

P-GATCCCGG-OH3’

GGCC-P5’BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②adapter的作用22基因的重組與轉(zhuǎn)移Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接頭自我連接23基因的重組與轉(zhuǎn)移24基因的重組與轉(zhuǎn)移接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接25基因的重組與轉(zhuǎn)移5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP處理-OHHO-26基因的重組與轉(zhuǎn)移Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。27基因的重組與轉(zhuǎn)移三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補(bǔ)；5’端6~10bp是某個內(nèi)切酶的識別序列。（5’端多余的3~5bp屬保護(hù)堿基）避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。28基因的重組與轉(zhuǎn)移引物1GCAGAATTC互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’GCAGAATTC互補(bǔ)序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互補(bǔ)序列PCR產(chǎn)物5’--3’3’復(fù)性延伸模板模板3’3’29基因的重組與轉(zhuǎn)移GCTAGCCGG互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’3-’5’復(fù)性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互補(bǔ)序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGGPCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列-5’3’-引物230基因的重組與轉(zhuǎn)移帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTCPCR產(chǎn)物5’--3’GCTAGCCGGPCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTCPCR產(chǎn)物5’--3’GCTAGPCR產(chǎn)物-5’3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！31基因的重組與轉(zhuǎn)移2.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個3’端一般都有一個ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個3’端人為地各加一個T利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時，被迫在平端載體上添加T！32基因的重組與轉(zhuǎn)移AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA33基因的重組與轉(zhuǎn)移34基因的重組與轉(zhuǎn)移35基因的重組與轉(zhuǎn)移36基因的重組與轉(zhuǎn)移四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進(jìn)行非互補(bǔ)的粘性末端連接。37基因的重組與轉(zhuǎn)移EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。38基因的重組與轉(zhuǎn)移2.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI39基因的重組與轉(zhuǎn)移3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼子尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼子的時候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！40基因的重組與轉(zhuǎn)移4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’3’載體插入片斷41基因的重組與轉(zhuǎn)移1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個載體與幾個插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5.幾個載體與一個插入片段重組（能存活）42基因的重組與轉(zhuǎn)移43基因的重組與轉(zhuǎn)移DNA連接方法小結(jié)平頭連接效率比粘性末端要低的多。

linker使用前必須考慮插入片段的甲基化問題。Adaptor使用必須考慮adapter的磷酸化問題。應(yīng)該時刻留心有無被利用部分填平粘性末端方法的機(jī)會。T載體可以用于PCR產(chǎn)物的克隆。不同的粘頭切口可以用于定向連接。44基因的重組與轉(zhuǎn)移1.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。第二節(jié)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備45基因的重組與轉(zhuǎn)移使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種46基因的重組與轉(zhuǎn)移47基因的重組與轉(zhuǎn)移用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理48基因的重組與轉(zhuǎn)移4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.5Onice5-30min4℃離心收集菌用冰冷的0.1MCaCl2重懸4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的0.1MCaCl2重懸49基因的重組與轉(zhuǎn)移大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的要點(diǎn)1、大腸桿菌感受態(tài)的準(zhǔn)備方法很多，例如：CaCl2法，CsCl法，超級感受態(tài)制備方法，電擊法。2、大腸桿菌感受態(tài)的準(zhǔn)備共同特點(diǎn)是，試劑純度要求比較高（微量的雜質(zhì)都會影響大腸桿菌的活性）。3、感受態(tài)制備過程中，要求嚴(yán)格的低溫，任何升溫過程都影響感受態(tài)的大腸桿菌活性。4、感受態(tài)大腸桿菌十分的脆弱，操作過程中必須十分的輕緩，防止攪動和震動。50基因的重組與轉(zhuǎn)移二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。51基因的重組與轉(zhuǎn)移每

gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法2.轉(zhuǎn)化率簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/

gDNA）。（1）熱激法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/

gDNA）。（2）電擊轉(zhuǎn)化法52基因的重組與轉(zhuǎn)移10ng載體DNA200

L感受態(tài)菌Onice混合，靜置30分鐘42oC90秒加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖45min-1h10-100

L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱激法53基因的重組與轉(zhuǎn)移54基因的重組與轉(zhuǎn)移55基因的重組與轉(zhuǎn)移56基因的重組與轉(zhuǎn)移57基因的重組與轉(zhuǎn)移LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，4℃離心集菌冰冷的10%甘油重懸菌體4℃離心集菌冰冷的10%甘油重懸菌體4℃離心收集菌體少量冰冷的10%甘油重懸分裝成50-300

L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25

F脈沖控制器200-400

0.5

g質(zhì)粒DNAOnice混合，30min加入1mLSOC培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100

L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法58基因的重組與轉(zhuǎn)移59基因的重組與轉(zhuǎn)移各種轉(zhuǎn)化方法的比較CaCl2法比較經(jīng)典，方法簡便易掌握，適合多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求，目前很多尖端實(shí)驗(yàn)室仍然使用。RbCl2方法，具備了CaCl2法的基本特點(diǎn)，轉(zhuǎn)化效率比CaCl2法要高，但RbCl2較貴。超級感受態(tài)方法比較煩瑣，但轉(zhuǎn)化效率很高，特別適合質(zhì)粒文庫的構(gòu)建。電擊法的轉(zhuǎn)化效率也很高，但需要特別的儀器。

60基因的重組與轉(zhuǎn)移4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100

L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜61基因的重組與轉(zhuǎn)移環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒5.影響轉(zhuǎn)化率的因素62基因的重組與轉(zhuǎn)移①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞（competentcells)63基因的重組與轉(zhuǎn)移把重組的噬菌體

DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的

噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細(xì)胞表面的

DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。64基因的重組與轉(zhuǎn)移cI857基因是個溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)菌時能夠保持溶源性。（3）cI857基因突變的

噬菌體但當(dāng)溫度升高到44℃—45℃時，就會導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，

DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。但由于該噬菌體的S基因上有一個突變，所以細(xì)菌還不裂解。65基因的重組與轉(zhuǎn)移cI857其它基因溶源狀態(tài)（

DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）

DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃

DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32℃66基因的重組與轉(zhuǎn)移

噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的

噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型

噬菌體。（4）互補(bǔ)型噬菌體外殼蛋白基因D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。

噬菌體267基因的重組與轉(zhuǎn)移(5)體外包裝過程68基因的重組與轉(zhuǎn)移體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每

g

DNA能形成106噬菌斑）。（6）轉(zhuǎn)導(dǎo)69基因的重組與轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）；不育的菌株（不會與其他酵母接合）。第三節(jié)外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his3

170基因的重組與轉(zhuǎn)移（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細(xì)胞壁具有通透性，允許DNA進(jìn)入。CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。轉(zhuǎn)化71基因的重組與轉(zhuǎn)移

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化72基因的重組與轉(zhuǎn)移葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1.葉盤法（leafdisk)73基因的重組與轉(zhuǎn)移植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25