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文檔簡介
實驗7-8植物組織培養(yǎng)
(planttissueculture)
一、實驗?zāi)康拿鞔_植物組織培養(yǎng)概念,掌握植物組織培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)。組織培養(yǎng):在無菌條件下,將離體的植物器官、組織、細胞以及原生質(zhì)體,在人工控制的環(huán)境里培養(yǎng)成完整植株的過程。
二、實驗內(nèi)容和原理實驗內(nèi)容:1、利用母液配制培養(yǎng)基——防沉淀、防失活、合適pH、高壓滅菌。2、選取無菌外植體接種。在無菌條件下,將滅過菌的材料,經(jīng)適當(dāng)切割,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上。3、控制條件下培養(yǎng),觀察成苗全過程。實驗原理:植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)--植物細胞全能性(totipotency)。植物的每個細胞都包含著該物種的全部遺傳信息,從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。在適宜條件下,任何一個細胞都可以發(fā)育成一個新個體。(1)外植體(explant)
:用于離體培養(yǎng)的各種植物材料。(2)脫分化(dedifferentiation):在組織培養(yǎng)中,外植體周圍細胞可進行細胞分裂,這種原已分化的細胞在一定的條件下,失去原有的形態(tài)和機能,重新恢復(fù)細胞分裂能力。(3)愈傷組織(callus):在組織培養(yǎng)中,外植體的脫分化,分裂形成的沒有分化的無組織的細胞團。(3)再分化(redifferentiation):愈傷組織在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下(繼代培養(yǎng)),再度分化形成另一種或幾種類型的細胞過程。
初代培養(yǎng)(primaryculture):指在組織培養(yǎng)過程中,最初建立的外植體無菌培養(yǎng)階段。由于首批外植體來源復(fù)雜,攜帶較多細菌,要對培養(yǎng)條件進行適應(yīng),因此,初代培養(yǎng)一般比較困難。繼代培養(yǎng)(subculture):在組織培養(yǎng)過程中,當(dāng)外植體被接種一段時間后,將已經(jīng)形成愈傷組織或已經(jīng)分化根、莖、葉、花等的培養(yǎng)物重新切割,轉(zhuǎn)接到其它培養(yǎng)基上以進一步擴大培養(yǎng)的過程稱為繼代培養(yǎng)。愈傷組織2.廣泛應(yīng)用(1)快繁脫毒馬鈴薯、草莓、貝母、百合、芋頭、甘蔗。
(2)植物天然藥物工廠化生產(chǎn)麥角菌、靈芝、猴頭菇等真菌進行工業(yè)化生產(chǎn),高等植物組織培養(yǎng)在工業(yè)化中的應(yīng)用也正在研究。紅豆杉
(3)植物轉(zhuǎn)基因研究愈傷組織是很好的轉(zhuǎn)基因材料。轉(zhuǎn)基因抗性鑒定葉片涂抹200mg/L草丁膦共培養(yǎng)誘導(dǎo)叢生芽篩選叢生芽莖誘導(dǎo)莖誘導(dǎo)生根轉(zhuǎn)基因苗幼苗GUS染色轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖?、主要儀器設(shè)備:無菌(光照)培養(yǎng)室、超凈工作臺,高壓滅菌鍋、pH計等。四、操作方法與實驗步驟:(一)培養(yǎng)劑配制
培養(yǎng)基種類:MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等等。母液配制(實驗書表)大量元素——N、P、K、Ca、Mg、S
微量元素——Fe、I、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co
有機物——肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸植物激素——NAA、6-BA(生長調(diào)節(jié)劑)蔗糖——碳源營養(yǎng),
滲透調(diào)節(jié)
信號物質(zhì)MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L每個大實驗臺上的8名同學(xué)共配500ml。1、先在搪瓷量杯中加入約350ml蒸餾水,依次加入下列組份并攪拌溶解:大量元素(10×)50mlCaCl2(100×)5ml微量元素(100×)5ml鐵鹽(100×)5ml肌醇(100×)5ml煙酸0.5mg/ml0.5ml鹽酸吡哆醇(0.5mg/ml)0.5ml鹽酸硫胺素(0.1mg/ml)0.5ml甘氨酸(2.0mg/ml)0.5mlNAA(0.1mg/ml)0.5ml6-BA(1.0mg/ml)0.5ml
蔗糖15.0g2、定容到500ml。3、測pH并調(diào)到5.8。4、加瓊脂3.5g,加熱熔化(煮沸2次),補充蒸餾水至500ml刻度液面。5、分裝到試管。每人共分裝2管,每管培養(yǎng)基液面高度2-3cm。擰蓋密封。以大實驗臺號+實驗時間段進行批次標(biāo)記。6、高壓蒸汽滅菌。121℃15-20min。本滅菌鍋從進到出2h。7、冷卻凝固,4-10℃下貯存,為下次備用。(二)接種(下周實驗)1.選擇花椰菜細枝梗,先用流水沖洗表面污物,接著用75%的酒精浸泡30s,用無菌鑷子轉(zhuǎn)移到小瓶無菌水中,再在10%的次氯酸鈉溶液中浸泡10min(兩種消毒劑都必須及時加蓋密封,以免揮發(fā)影響濃度,中間需搖晃數(shù)次),然后取出用無菌水沖洗3-4遍(置于無菌水中備用)。把制好的培養(yǎng)基,放在超凈工作臺上,以便取用。2.點燃酒精燈。棉球擦拭雙手及臺面。3.將鑷子和解剖刀插入電子殺菌器中20s以上,取出鑷子,待刀冷卻后,夾取一張無菌濾紙置于酒精燈前方。用鑷子取出滅菌過的花椰菜細枝梗,置濾紙中間,用鑷子夾住,將花椰菜細枝梗(外植體)切割成0.5-1cm的小段,取2~3塊接種于培養(yǎng)基上(操作時盡量靠近酒精燈火焰),及時擰好管蓋。4.接種完畢,作好標(biāo)記,清理臺面。五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理:觀察愈傷組織生長和分化,拍攝動態(tài)照片。六、實驗結(jié)果與分析:分析培養(yǎng)過程愈傷組織生長和分化情況
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