植物組織培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)7-8植物組織培養(yǎng)

（planttissueculture）

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿鞔_植物組織培養(yǎng)概念，掌握植物組織培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)。組織培養(yǎng)：在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體，在人工控制的環(huán)境里培養(yǎng)成完整植株的過程。

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、利用母液配制培養(yǎng)基——防沉淀、防失活、合適pH、高壓滅菌。2、選取無菌外植體接種。在無菌條件下，將滅過菌的材料，經(jīng)適當(dāng)切割，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上。3、控制條件下培養(yǎng)，觀察成苗全過程。實(shí)驗(yàn)原理：植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)－－植物細(xì)胞全能性（totipotency）。植物的每個(gè)細(xì)胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。在適宜條件下，任何一個(gè)細(xì)胞都可以發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體。（1）外植體（explant）

：用于離體培養(yǎng)的各種植物材料。（2）脫分化（dedifferentiation）：在組織培養(yǎng)中，外植體周圍細(xì)胞可進(jìn)行細(xì)胞分裂，這種原已分化的細(xì)胞在一定的條件下，失去原有的形態(tài)和機(jī)能，重新恢復(fù)細(xì)胞分裂能力。（3）愈傷組織（callus）：在組織培養(yǎng)中，外植體的脫分化，分裂形成的沒有分化的無組織的細(xì)胞團(tuán)。（3）再分化（redifferentiation）：愈傷組織在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下（繼代培養(yǎng)），再度分化形成另一種或幾種類型的細(xì)胞過程。

初代培養(yǎng)（primaryculture）：指在組織培養(yǎng)過程中，最初建立的外植體無菌培養(yǎng)階段。由于首批外植體來源復(fù)雜，攜帶較多細(xì)菌，要對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行適應(yīng)，因此，初代培養(yǎng)一般比較困難。繼代培養(yǎng)（subculture）：在組織培養(yǎng)過程中，當(dāng)外植體被接種一段時(shí)間后，將已經(jīng)形成愈傷組織或已經(jīng)分化根、莖、葉、花等的培養(yǎng)物重新切割，轉(zhuǎn)接到其它培養(yǎng)基上以進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)的過程稱為繼代培養(yǎng)。愈傷組織2.廣泛應(yīng)用（１）快繁脫毒馬鈴薯、草莓、貝母、百合、芋頭、甘蔗。

（２）植物天然藥物工廠化生產(chǎn)麥角菌、靈芝、猴頭菇等真菌進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，高等植物組織培養(yǎng)在工業(yè)化中的應(yīng)用也正在研究。紅豆杉

（3）植物轉(zhuǎn)基因研究愈傷組織是很好的轉(zhuǎn)基因材料。轉(zhuǎn)基因抗性鑒定葉片涂抹200mg/L草丁膦共培養(yǎng)誘導(dǎo)叢生芽篩選叢生芽莖誘導(dǎo)莖誘導(dǎo)生根轉(zhuǎn)基因苗幼苗GUS染色轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖?、主要儀器設(shè)備：無菌（光照）培養(yǎng)室、超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋、pH計(jì)等。四、操作方法與實(shí)驗(yàn)步驟：（一）培養(yǎng)劑配制

培養(yǎng)基種類:MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等等。母液配制（實(shí)驗(yàn)書表）大量元素——N、P、K、Ca、Mg、S

微量元素——Fe、I、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co

有機(jī)物——肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸植物激素——NAA、6-BA（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）蔗糖——碳源營(yíng)養(yǎng)，

滲透調(diào)節(jié)

信號(hào)物質(zhì)MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L每個(gè)大實(shí)驗(yàn)臺(tái)上的8名同學(xué)共配500ml。1、先在搪瓷量杯中加入約350ml蒸餾水，依次加入下列組份并攪拌溶解：大量元素(10×)50mlCaCl2(100×)5ml微量元素(100×)5ml鐵鹽(100×)5ml肌醇(100×)5ml煙酸0.5mg/ml0.5ml鹽酸吡哆醇(0.5mg/ml)0.5ml鹽酸硫胺素(0.1mg/ml)0.5ml甘氨酸(2.0mg/ml)0.5mlNAA(0.1mg/ml)0.5ml6-BA(1.0mg/ml)0.5ml

蔗糖15.0g2、定容到500ml。3、測(cè)pH并調(diào)到5.8。4、加瓊脂3.5g，加熱熔化(煮沸2次)，補(bǔ)充蒸餾水至500ml刻度液面。5、分裝到試管。每人共分裝2管，每管培養(yǎng)基液面高度2-3cm。擰蓋密封。以大實(shí)驗(yàn)臺(tái)號(hào)+實(shí)驗(yàn)時(shí)間段進(jìn)行批次標(biāo)記。6、高壓蒸汽滅菌。121℃15-20min。本滅菌鍋從進(jìn)到出2h。7、冷卻凝固，4－10℃下貯存，為下次備用。（二）接種（下周實(shí)驗(yàn)）1.選擇花椰菜細(xì)枝梗，先用流水沖洗表面污物，接著用75%的酒精浸泡30s，用無菌鑷子轉(zhuǎn)移到小瓶無菌水中，再在10%的次氯酸鈉溶液中浸泡10min（兩種消毒劑都必須及時(shí)加蓋密封，以免揮發(fā)影響濃度，中間需搖晃數(shù)次），然后取出用無菌水沖洗3-4遍（置于無菌水中備用）。把制好的培養(yǎng)基，放在超凈工作臺(tái)上，以便取用。2.點(diǎn)燃酒精燈。棉球擦拭雙手及臺(tái)面。3.將鑷子和解剖刀插入電子殺菌器中20s以上，取出鑷子，待刀冷卻后，夾取一張無菌濾紙置于酒精燈前方。用鑷子取出滅菌過的花椰菜細(xì)枝梗，置濾紙中間，用鑷子夾住，將花椰菜細(xì)枝梗（外植體）切割成0.5-1cm的小段，取2～3塊接種于培養(yǎng)基上（操作時(shí)盡量靠近酒精燈火焰），及時(shí)擰好管蓋。4.接種完畢，作好標(biāo)記，清理臺(tái)面。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理：觀察愈傷組織生長(zhǎng)和分化，拍攝動(dòng)態(tài)照片。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：分析培養(yǎng)過程愈傷組織生長(zhǎng)和分化情況