轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

1本規(guī)范規(guī)定了轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制策劃、制備、均勻性評(píng)估、穩(wěn)定性評(píng)估、互換性評(píng)估、定值、不確定度評(píng)定、研制報(bào)告和證書、包裝和保存等要求，適用于JJF1342標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制(生產(chǎn))機(jī)構(gòu)通用要求GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定GB8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)通用要求NY/T1101轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全性評(píng)價(jià)導(dǎo)則《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》(中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院令第304號(hào))全國(guó)科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會(huì).遺傳學(xué)名詞凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。通過(guò)基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的植物。3.3轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)geneticallymodifiedplantnucleic具有足夠均勻和穩(wěn)定的特性，用于轉(zhuǎn)基因植物核酸成分測(cè)量程序校準(zhǔn)、確認(rèn)與質(zhì)量23以轉(zhuǎn)基因植物提取的基因組制成的物質(zhì)，為轉(zhuǎn)基因植物基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(genetically3.4質(zhì)粒plasmid細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。3.5基因組genome一種生物體具有的所有遺傳信息的總和。在聚合作用的起始時(shí)，可以引發(fā)合成另一種大分子，并與反應(yīng)物以共價(jià)鍵形式連接的寡核苷酸序列。3.7內(nèi)源參考基因endogenousreferencegene在生物體自身基因組內(nèi)，具有恒定拷貝數(shù)，不發(fā)生等位基因變異的特定序列基因，可用于分析目標(biāo)生物體基因組和基因表達(dá)。3.8外源基因exogenousgene經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因步驟導(dǎo)入受體細(xì)胞的基因。【全國(guó)科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會(huì).遺傳學(xué)名詞03.122】plasmidreferencemat轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的屬性，是指利用轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和轉(zhuǎn)基因植物基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增時(shí)的擴(kuò)增效率、所產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距和線性相關(guān)系數(shù)的一致性。4通用性原則4.1應(yīng)遵照J(rèn)JF1342、JJF1343對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的相關(guān)要求。4.2轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制場(chǎng)所、操作活動(dòng)、廢物處理等應(yīng)該遵照國(guó)家法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)際公約、轉(zhuǎn)基因生物安全管理等的相關(guān)要求。35.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制機(jī)構(gòu)承擔(dān)轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制(生產(chǎn))項(xiàng)目的策劃和管理。5.2轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的類型和不確定度水平應(yīng)適用于其在不同轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品核酸檢測(cè)中的預(yù)期用途，包括測(cè)量程序校準(zhǔn)、確認(rèn)、質(zhì)量控制以及轉(zhuǎn)基因5.3根據(jù)進(jìn)出口貿(mào)易、市場(chǎng)監(jiān)管、生物安全評(píng)估等需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.4評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物或原料的可獲得性，并說(shuō)明候選物的轉(zhuǎn)基因5.5評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法的計(jì)量溯源性。5.6評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性、互換性等方法的適用性滿足標(biāo)準(zhǔn)6.1.1候選物材料來(lái)源應(yīng)清楚，信息完整，包括典型性、轉(zhuǎn)化體純度、轉(zhuǎn)化體純合度、重組質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)化體特異性外源基因序列、轉(zhuǎn)基因生物安全管理和登記信息等。當(dāng)國(guó)際公約、國(guó)家法規(guī)有規(guī)定時(shí)，應(yīng)說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的候選物來(lái)源的合法性。6.1.2候選物的選擇應(yīng)滿足適用性、代表性，以及容易復(fù)制的原則。候選物應(yīng)有足夠6.1.3候選物的鑒定應(yīng)科學(xué)合理，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不同類型進(jìn)行鑒定。如農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因植物基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的鑒定應(yīng)包括典型性鑒定、轉(zhuǎn)化體純度、轉(zhuǎn)化體純合度等，可參照GB/T3543.5分別確定轉(zhuǎn)基因植物候選物中插入的外源基因的真實(shí)性、遺傳背景和純度，其中候選物的外源基因和內(nèi)源參考基因等位基因的檢測(cè)純度均應(yīng)大于99.9%。6.2.1制備的轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)與實(shí)際分析樣品的基體盡可能保持一致，適6.2.2轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒和基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度應(yīng)滿足吸光值A(chǔ)?o/A?so值介于1.8～1.9之間，A?so/A?so值大于2.0。6.2.4包裝應(yīng)滿足該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的預(yù)期用途。一7.1JJF1343對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性評(píng)估的要求適用于轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。47.2.1應(yīng)根據(jù)轉(zhuǎn)基因植物核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的類型、狀態(tài)等制定均勻性評(píng)估方案，選擇不7.2.2轉(zhuǎn)基因植物基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法評(píng)估外源基因與內(nèi)源參考基因拷貝數(shù)比值的均勻性，也可采用可靠的間接方法評(píng)估轉(zhuǎn)7.2.3轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：外源基因拷貝數(shù)、內(nèi)源參考基因拷貝數(shù)以及兩者比值的7.2.4轉(zhuǎn)基因植物基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：同7.2.2。JJF1343對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性評(píng)估的9.1評(píng)估原則9.1.1研制轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，應(yīng)評(píng)估其與轉(zhuǎn)基因植物基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或基因組標(biāo)9.1.2進(jìn)行互換性評(píng)估前應(yīng)設(shè)計(jì)互換性評(píng)估方案。參與互換性驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室不少于3家。9.1.3內(nèi)源參考基因和外源基因應(yīng)同時(shí)滿足互換性要求?；Q性僅存在于特定轉(zhuǎn)化體9.1.4應(yīng)在相同的條件下測(cè)量特定轉(zhuǎn)化體的基因組和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過(guò)數(shù)學(xué)相關(guān)性a)應(yīng)明確參加實(shí)驗(yàn)室個(gè)數(shù)、實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)、測(cè)量方法、基因組來(lái)源、統(tǒng)計(jì)方法、原b)應(yīng)優(yōu)先選用轉(zhuǎn)基因植物基體有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得基因組，在此類有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)無(wú)法獲得時(shí)可選擇經(jīng)確定為該品系的轉(zhuǎn)基因植物組織如葉片來(lái)獲得基因組。c)在進(jìn)行互換性評(píng)估時(shí)，基因組和待評(píng)估的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度不少于5個(gè)水平，基因組的濃度范圍需與待評(píng)估質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度范圍相同或相近。包括擴(kuò)增效率，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合度、截距分析等。轉(zhuǎn)基因基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值是指轉(zhuǎn)基因植物組織粉末與非轉(zhuǎn)基因植物組織粉末的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)基因外源基因與內(nèi)源參考基因拷貝數(shù)比值。a)單一實(shí)驗(yàn)室采用基準(zhǔn)方法重量法確定轉(zhuǎn)基因植物組織粉末與非轉(zhuǎn)基因植物組織b)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，由多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值，如數(shù)字PCR或熒光定量PCR方法。若采用2種方法多家合作定值，應(yīng)由不少于6個(gè)實(shí)驗(yàn)室參與定值；若采用1種方法合作定值，應(yīng)由不少于8個(gè)實(shí)驗(yàn)室參與定值。10.2轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和轉(zhuǎn)基因植物基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值10.2.1轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因植物基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒和基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值應(yīng)包括外源基因與內(nèi)源參考基因拷貝數(shù)比值10.2.2轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒和基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方式的選擇a)由單一實(shí)驗(yàn)室采用兩種可溯源的絕對(duì)方法，如數(shù)字PCR方法和測(cè)序方法兩種方法確定轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒和基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外源基因與內(nèi)源參考基因拷貝數(shù)比值；采用同位素稀釋質(zhì)譜方法和數(shù)字PCR方法確定轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒和b)使用一種方法，應(yīng)由不少于8個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值。10.3.1由單一實(shí)驗(yàn)室完成定值的，該實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期參加國(guó)際計(jì)量比對(duì)并取得國(guó)際等10.3.2采用合作定值方式時(shí)，應(yīng)通過(guò)組織計(jì)量比對(duì)、能力驗(yàn)證、測(cè)量審核等方式篩選a)主導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室與參與定值實(shí)驗(yàn)室簽訂定值合同，合同中應(yīng)包括質(zhì)量控制要求和b)根據(jù)定值合同的要求實(shí)施測(cè)量活動(dòng)，包括測(cè)量的單元數(shù)、重復(fù)次數(shù)等。d)保證每次測(cè)量的獨(dú)立性，如不同的操作人員、不同測(cè)量時(shí)間、不同的實(shí)驗(yàn)裝e)應(yīng)記錄所有與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值相關(guān)的重要活動(dòng)和數(shù)據(jù)f)按照J(rèn)JF1059.1的原則識(shí)別、控制不確定度來(lái)源，并在需要時(shí)評(píng)定測(cè)量不確定值數(shù)據(jù)審核、數(shù)據(jù)評(píng)估和統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)按JJF1343、JJF1059.1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果及不確定度應(yīng)由研制機(jī)構(gòu)按照J(rèn)JF1343、JJF1059.1進(jìn)行評(píng)定11.1.1應(yīng)依據(jù)JJF1218的要求以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理部門的規(guī)定，編制轉(zhuǎn)基因植物核酸6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制報(bào)告。11.1.2研制報(bào)告應(yīng)描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制策劃、轉(zhuǎn)基因候選物來(lái)源、制備、均勻性評(píng)估、穩(wěn)定性評(píng)估、互換性評(píng)估、定值、方法確認(rèn)及溯源性、不確定度評(píng)定、包裝和保存等信息，并提供充分的數(shù)據(jù)及分析信息，按JJF1059.1和GB8170對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行修約。11.2證書和標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的編寫和標(biāo)簽的內(nèi)容應(yīng)符合JJF1186的要求標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)按照長(zhǎng)期穩(wěn)定性保存條件儲(chǔ)存，保證在有效期內(nèi)維持其性能參數(shù)。7A.1互換性評(píng)估互換性評(píng)估是對(duì)轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒和基體或基因組的PCR擴(kuò)增斜率、標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距和線性相關(guān)系數(shù)的一致性進(jìn)行分析，兩者的PCR擴(kuò)增效率、截距和線性相關(guān)系數(shù)偏差越大，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互換性越差。A.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇不少于3家實(shí)驗(yàn)室使用熒光定量PCR方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因玉米NK603質(zhì)粒和基因組的互換性研究。分別對(duì)質(zhì)粒和基因組進(jìn)行5倍稀釋，稀釋5個(gè)濃度。參加互換性評(píng)估的實(shí)驗(yàn)室提交3次測(cè)定所得到的PCR擴(kuò)增效率、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合度(R2)和截距，以及測(cè)定結(jié)果的原始數(shù)據(jù)(PCR擴(kuò)增Ct值),格式見(jiàn)表A.1和表A.2。次數(shù)內(nèi)源參考基因Ct(設(shè)置3個(gè)平行)外源基因Ct(設(shè)置3個(gè)平行)1231231234512345123458次數(shù)內(nèi)源參考基因Ct(設(shè)置3個(gè)平行)外源基因Ct(設(shè)置3個(gè)平行)123123123451234512345A.3數(shù)據(jù)處理首先以擴(kuò)增得到的Ct值作為Y,相對(duì)應(yīng)的DNA濃度的對(duì)數(shù)作為X,進(jìn)行線性擬合，得到Y(jié)=aX+b的線性方程，其中a為直線的斜率，b為直線的截距。然后將直線的斜率根據(jù)公式(A.1)換算成PCR擴(kuò)增效率。將各家實(shí)驗(yàn)室的擴(kuò)增效率E、截距、線性擬合度R2按照表A.3～表A.5整理。A.4互換性結(jié)果評(píng)價(jià)采用F檢驗(yàn)對(duì)表A.3～表A.5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在95%的包含區(qū)間內(nèi)，取a=0.05,計(jì)算臨界p值。若計(jì)算得到的p>0.05,即在F分布的95%的包含區(qū)間內(nèi)，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)沒(méi)有差別。若計(jì)算得到的p<0.05,認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)有顯著性差別。通過(guò)分析3家實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別對(duì)基因組和質(zhì)粒的擴(kuò)增效率、線性擬合度和截距進(jìn)行互換性的評(píng)價(jià)，如果基因組和質(zhì)粒的擴(kuò)增效率、截距和線性擬合度均無(wú)顯著差異，則二者之間可以實(shí)現(xiàn)互換；反之，則質(zhì)粒與基因組無(wú)法實(shí)現(xiàn)互換。9表A.3PCR擴(kuò)增效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果(基因組n=9,質(zhì)粒n=9)測(cè)量外源基因擴(kuò)增效率/%表A.4標(biāo)準(zhǔn)曲線R2統(tǒng)計(jì)結(jié)果(基因組n=9,質(zhì)粒n=9)測(cè)量外源基因R2內(nèi)源參考基因R2表A.5標(biāo)準(zhǔn)曲線截距統(tǒng)計(jì)結(jié)果(基因組n=9,質(zhì)粒n=9)次數(shù)外源基因截距內(nèi)源參考基因截距表A.5(續(xù))次數(shù)外