水質(zhì) 8種喹諾酮類抗生素的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1水質(zhì)8種喹諾酮類抗生素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件描述了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水中8種喹諾酮類（沙星類）抗生素的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、樣品制備、實驗步驟、結(jié)果計算、精密度、檢出限和定量限。本文件適用于地表水和廢水中麻保沙星（Marbofloxacin）、氟羅沙星（Fleroxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、恩諾沙星（Enrofloxacin）、奧比沙星（Orbifloxacin）、沙氟沙星（Sarafloxacin）、雙氟哌酸（Difloxacin）和司帕沙星（Sparfloxacin）共8種喹諾酮類抗生素的測定，其他喹諾酮類化合物經(jīng)適用性驗證可參照執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ/T92水污染物排放總量監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理水中的喹諾酮類抗生素采用固相萃取柱富集，用液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）儀進行檢測。根據(jù)保留時間和特征離子峰定性，外標法定量。5試劑和材料5.1除另有說明外，所用試劑均為分析純，實驗用水應符合GB/T6682中一級水的要求。5.2乙腈（CH3CN）：色譜純。5.3甲醇（CH3OH）：色譜純。5.4甲酸（HCOOH）：ρ（HCOOH）=1.22g/mL。5.5硫酸（H2SO4ρ（H2SO4）=1.84g/mL。5.6氫氧化鈉（NaOH）。5.7乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)。5.8氫氧化鈉溶液：ρ（NaOH）=0.4g/mL。稱取40g氫氧化鈉（5.6）溶于水中，定容至100mL。5.9甲酸溶液：1+2000。取1mL甲酸（5.4）加入2000mL水中。5.10甲酸/甲醇混合溶液：1+1000。取1mL甲酸（5.4）加入1000mL甲醇（5.3）中。5.11喹諾酮類抗生素標準貯備液：ρ=100μg/mL（甲醇介質(zhì)）。可直接購買有證標準溶液，也可用固體標準物質(zhì)制備，組分包括麻保沙星、氟羅沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、沙氟沙星、雙氟哌酸和司帕沙星。貯備液在-20℃以下避光保存或參照制造商的產(chǎn)品說明。使用時應恢復至室溫，并搖25.12喹諾酮類抗生素標準使用液：ρ=1.0μg/mL(參考濃度)。將喹諾酮類抗生素標準貯備液（5.11）按需要用甲醇（5.3）稀釋。標準使用液現(xiàn)配現(xiàn)用。5.13濾膜：13mm，0.22μm，有機相。5.14氮氣：純度≥99.99％。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧電離源（ESI）。6.2色譜柱：填料為3.5μmODS，柱長10cm，內(nèi)徑2.1mm的反相色譜柱或其他等效C18反相液相色譜柱。6.3固相萃取裝置：自動或手動，流速可調(diào)節(jié)。6.4固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物或等效萃取柱，規(guī)格為6mL/200mg。6.5濃縮裝置：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置或氮吹濃縮儀等性能相當?shù)脑O(shè)備。6.6pH計：精度為0.01個pH單位，具有溫度補償功能。6.7微量注射器或移液槍：10μL、50μL、100μL、250μL、1000μL。6.8采樣瓶：250mL或500mL具磨口塞的棕色玻璃瓶。7樣品制備7.1樣品采集7.1.1按照HJ/T91和HJ/T92的相關(guān)規(guī)定采集樣品。7.1.2用預先洗滌干凈并干燥的磨口棕色玻璃瓶（6.8）采集水樣，采樣前不應用水樣預洗采樣瓶，采樣瓶應完全注滿不留氣泡。7.2樣品保存水樣4℃以下冷藏，避光保存，3d內(nèi)萃取完畢。7.3試樣制備7.3.1直接進樣法取適量水樣經(jīng)0.22μm濾膜（5.13）過濾，置于進樣瓶中，等待進樣。7.3.2固相萃取法分別用10mL甲醇（5.3）和10mL水活化固相萃取柱（6.4），在活化過程中應確保小柱中填料表面不露出液面。量取200mL水樣，加入0.5gEDTA（5.7），使用硫酸（5.5）或氫氧化鈉溶液（5.8）調(diào)節(jié)水樣的pH值至3.0±0.1，水樣以約5mL/min的流速通過固相萃取柱。再用10mL水淋洗小柱，去除雜質(zhì)。之后用氮氣（5.14）吹干小柱。用3mL甲酸/甲醇混合溶液（5.10）洗脫富集后的小柱，再用3mL甲酸/甲醇混合溶液（5.10）浸泡小柱5min，用6mL甲酸/甲醇混合溶液（5.10）以1mL/min的速度洗脫樣品，收集全部洗脫液。用濃縮裝置（6.5）將上述洗脫液濃縮至1.0mL以下，用甲醇（5.3）定容至1.0mL，混勻后過0.22μm濾膜（5.13），置于進樣瓶中，待測。7.4空白試樣的制備7.4.1實驗室空白7.4.1.1以水代替樣品，按照水樣處理（7.3.1）相同操作步驟，制備直接進樣法空白試樣。7.4.1.2以水代替樣品，按照水樣處理（7.3.2）相同操作步驟，制備固相萃取法空白試樣。7.4.2全程序空白采樣前按照樣品采集（7.1）和樣品保存（7.2）方法，用水代替樣品，在采樣現(xiàn)場制備全程序空白樣品。8實驗步驟38.1儀器條件8.1.1液相色譜條件：——流動相：流動相A甲酸溶液1+2000（5.9）,流動相B乙腈（5.2）,梯度洗脫程序見表1；——流速：0.5mL/min；——柱溫：25℃;——進樣體積：5.0μL。表1液相色譜流動相梯度洗脫程序%%08.1.2質(zhì)譜條件：——電噴霧離子源（ESI）,正離子模式；——毛細管電壓：4.0kv；——干燥氣溫度：350℃;——干燥氣流速：11L/min；——霧化氣氣壓：25psi；——多離子反應監(jiān)測方式（MRM）,條件見表2。表2目標化合物的多離子反應監(jiān)測條件sV注：帶*的為定量離子。48.2校準8.2.1初始校準在初次使用儀器，或在儀器維修、更換色譜柱或連續(xù)校準不合格時需要進行初始校準。即建立標準曲線，校準曲線的相關(guān)系數(shù)≥0.995，否則重新繪制校準曲線。8.2.2連續(xù)校準CC?Ci用分析校準曲線的中間濃度點進行連續(xù)校準，每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）分析1次連續(xù)校準。按式（1）計算CCCC?CiD=D=Ci式中：D——Cc與校準點Ci的相對偏差，%;Ci——校準點的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為微克每升(μg/L)；Cc——測定的該校準點的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為微克每升(μg/L)。注：如果D≤20則初始標準曲線仍能繼續(xù)使用；如果任何一個化合物的D＞8.3校準曲線的繪制8.3.1取一定量喹諾酮類抗生素標準使用液（5.11），制備至少5個濃度點的標準系列，喹諾酮類抗生素的質(zhì)量濃度分別為2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L、80.0μg/L和100μg/L，貯存在棕色進樣小瓶中，校準曲線需臨用現(xiàn)配。8.3.2在儀器最佳工作條件下，對標準系列溶液進樣，以目標組分的峰面積為縱坐標，標準系列溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線。8.4樣品測定取待測試樣（7.3），按照與繪制校準曲線相同的儀器分析條件進行測定。8.5空白試驗按與試樣測定相同的條件（8.1）進行空白試樣（7.4）的測定。9結(jié)果計算及表示9.1目標化合物的定性分析在相同的實驗條件下，樣品中待測物質(zhì)的保留時間與標準溶液的保留時間偏差在±2.5％之內(nèi)；每種化合物的質(zhì)譜定性離子至少應包括一個母離子和兩個子離子，且樣品中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的混合標準溶液中對應的定性離子的相對豐度進行比較，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差20%25%30%50%9.2目標化合物的定量分析按條件分析，得到目標化合物的MRM色譜圖，參見附錄A。目標化合物經(jīng)定性鑒別后，根據(jù)定量離子的峰面積，用外標法計算。按公式（2）計算樣品中喹諾酮類化合物的質(zhì)量濃度：式中：ρi——樣品中組分i的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為納克每升（ng/L）；ρxi——從標準曲線中查得組分i的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為微克每升(μg/L）；5V1——萃取液濃縮定容后的體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）；V——水樣體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）。9.3結(jié)果顯示當直接進樣法的測定結(jié)果大于10.0μg/L時，數(shù)據(jù)保留三位有效數(shù)字，當結(jié)果小于10.0μg/L，保留至小數(shù)點后一位。當固相萃取法的測定結(jié)果大于10.0ng/L時，數(shù)據(jù)保留三位有效數(shù)字，當結(jié)果小于10.0ng/L，保留至小數(shù)點后一位。10精密度在同一實驗室