實驗五 植物染色體標本的制備和觀察

實驗五植物染色體標本的

制備和觀察一實驗?zāi)康恼莆粘Ｒ?guī)壓片法和去壁低滲法制備植物染色體標本的基本原理和方法。二實驗原理常規(guī)壓片法仍是當今觀察植物染色體常用的方法，其程序包括取材、預(yù)處理、固定、解離、染色和壓片等步驟。但壓片法的不足之處是染色體很難分散開，染色體容易變形和斷裂。去壁低滲法是借助纖維素酶和果膠酶將細胞間的果膠質(zhì)和組成細胞壁的α-纖維素、半纖維素溶解掉，使植物細胞只有質(zhì)膜，然后按哺乳類動物染色體標本制備的方法——低滲、火焰干燥法制備植物染色體標本。三實驗儀器、材料和試劑1儀器、用具：培養(yǎng)箱、顯微鏡等2材料：蠶豆種子3試劑：⑴秋水仙素⑵磷酸緩沖液⑶甲醇、冰醋酸⑷改良苯酚品紅染色液⑸混合酶液三實驗儀器、材料和試劑3試劑：⑹70%、85%、95%乙醇

⑺

1mol/LHCL

四實驗方法（壓片法制備染色體標本）

1

取材把蠶豆種子預(yù)先浸泡6小時，然后轉(zhuǎn)入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置25℃溫箱中發(fā)芽，幼根長至1～2cm左右，于上午13～14時剪下根尖0.5cm。2

預(yù)處理將剪下的根尖置0.02%秋水仙素溶液中，浸泡處理4小時。3

固定用水洗凈處理過的根尖，經(jīng)甲醇-冰醋酸（3∶1）固定6～24小時，再經(jīng)95%、85%酒精各半小時，最后轉(zhuǎn)入70%酒精中，4℃保存?zhèn)溆谩Ｋ膶嶒灧椒ǎ▔浩ㄖ苽淙旧w標本）4

解離取出根尖，用蒸餾水洗凈，放入1NHCl中60℃解離8～10min，再用蒸餾水洗凈。5染色改良苯酚品紅染色液染色5～10min。6

壓片把根尖放在載玻片上，切取分生區(qū)部分，加一滴染液，用鑷子搗碎，蓋上蓋玻片，然后在蓋玻片上放上一濾紙，用鉛筆上的橡皮頭輕輕敲打蓋片，使細胞和染色體分散。7

鏡檢。第一次壓片。取解離后的根尖用清水沖洗10s后，置于載玻片中間，用刀片切去根冠及伸長區(qū)部分，只留1-2mm分生區(qū)，另取載玻片與其交叉成“十”字型扣壓，將材料壓成薄層，而后小心分開兩載玻片。如此，兩載玻片中間區(qū)域皆附有一薄層材料。染色。用石炭酸品紅染色液，染色3min。第二次壓片。蓋上蓋玻片再履吸水紙，用拇指輕壓，亦可用鉛筆的橡皮頭在蓋玻片上輕敲數(shù)下，使根尖細胞擴散呈云霧狀。兩載玻片十字交叉平扣1

能使細胞均勻鋪開，克服采用蓋玻片時加壓用力不均勻的缺點；2

細胞均勻鋪開后染色，不僅縮短染色時間，而且可以克服對整個根尖染色，導(dǎo)致根尖內(nèi)外層細胞染色不均勻；3

一個根尖材料可同時制取兩個根尖細胞有絲分裂染色體標本裝片。采用兩次壓片取代教材中介紹的一次壓片，提高制片成功率，由于第二次壓片只要蓋好蓋玻片，輕點壓平即可，無須太過用力，避免過重擠壓而壓裂蓋玻片，導(dǎo)致實驗失敗或影響觀察效果。兩載玻片十字平扣交叉壓片好處多四實驗方法（去壁法制備染色體標本）1．取材將蠶豆種子放在25℃溫箱中發(fā)芽，待根長到1～2cm時使用。2．前處理根尖用0.1%秋水仙素溶液處理3～4小時。3．固定用水洗凈處理過的根尖，經(jīng)甲醇/冰醋酸（3∶1）固定2-24小時，換入70%酒精保存。四實驗方法（去壁法制備染色體標本）4．水解取出根尖，用蒸餾水洗凈，放入1NHCl中60℃解離14～15min，再用蒸餾水洗凈5染色改良苯酚品紅染色液染色5-10min。6漂洗漂洗液換洗2-3次，每次1-2min。

7酶解

切取著色深的分生區(qū)放到小杯中，加入混合酶液（2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶），25℃下酶解2～4小時。解離是除去細胞間的果膠層，并使細胞壁軟化，材料制片后細胞分散便于觀察.筆者長期實驗教學(xué)實踐表明，采用95%乙醇和濃鹽酸等量混合的解離液解離細胞，在58-60℃1mol/L熱鹽酸中水解細胞14-15min，染色后，滴1-2滴混合酶室溫下酶解細胞40min左右或在28℃溫箱中酶解20min左右的效果好.實踐表明，95%乙醇和濃鹽酸等量混合液進行解離操作，可簡化實驗步驟，且大大縮短實驗時間。四實驗方法（去壁低滲法制備染色體標本）8．洗滌倒去酶液，用蒸餾水慢慢沖洗2次，然后加入45%醋酸。9壓片吸取材料，置于載玻片，蓋上蓋玻片，然后在蓋玻片上放上一濾紙，用鉛筆上的橡皮頭輕輕敲打蓋片，使細胞和染色體分散。10鏡檢

預(yù)處理：切取長約5mm的植物根尖，浸入0.1%秋水仙素中，室溫下處理4小時將根尖放入1mol/L的鹽酸中，60℃水浴，恒溫條件下解離8~10min。解離后倒出HCl，水洗2次，每次3~5min。將材料直接浸入改良苯酚品紅中，蓋上蓋玻片。用鑷子或鉛筆輕輕敲打，使根尖細胞分散開。五作業(yè)繪出植物中期細胞染色體圖。在制片的過程中有哪些需要注意的問題？為什么在壓片前需要先經(jīng)過酸水解？比較常規(guī)壓片法和去壁低滲法制備植物染色體標本的效果。六注意事項