羅非魚鏈球菌病防控技術(shù)

一、技術(shù)名稱羅非魚鏈球菌病防控技術(shù)二、技術(shù)概述該技術(shù)從"病原－宿主－綠色漁藥"三個(gè)方面進(jìn)行研究，建立了羅非魚鏈球菌病的高效復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑防控技術(shù)。在病原方面，對(duì)引起羅非魚鏈球菌病暴發(fā)性疾病的病原進(jìn)行了分離鑒定，確定該菌為無(wú)乳鏈球菌強(qiáng)毒株；進(jìn)而對(duì)無(wú)乳鏈球菌及ECP致病性、耐藥性、蛋白組學(xué)、全基因組和基因分型等生物學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)研究，建立了鏈球菌LAMP快速診斷技術(shù)；對(duì)無(wú)乳鏈球菌強(qiáng)毒株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化；克隆了6個(gè)毒力蛋白基因并進(jìn)行了原核表達(dá)；構(gòu)建了PhoB基因缺失突變株和互補(bǔ)株并分析了突變株生物學(xué)特性，同時(shí)比較了野生株和突變株轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組圖譜；鑒定得到3條有效sRNA并獲取所有sRNA全長(zhǎng)，構(gòu)建了sRNASAR-1缺失突變株及回補(bǔ)株并分析突變株生物學(xué)特性，同時(shí)比較野生株和突變株蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。在宿主方面，克隆了羅非魚9個(gè)免疫相關(guān)基因全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其中4個(gè)基因進(jìn)行了原核表達(dá)，用表達(dá)蛋白制備了sIgM多抗并對(duì)羅非魚4個(gè)組織進(jìn)行了免疫組化分析；對(duì)滅活無(wú)乳鏈球菌誘導(dǎo)前后的羅非魚的免疫基因的組織分布差異以及在不同組織中的時(shí)間表達(dá)模式進(jìn)行了分析；通過(guò)構(gòu)建NCCRP-1胞外結(jié)合區(qū)域以及胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活化區(qū)+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)誘餌質(zhì)粒，從羅非魚肝臟和頭腎cDNA文庫(kù)中篩選出11個(gè)與NCCRP-1有潛在相互作用的蛋白，證實(shí)了NCCRP-1與C-typelectin、serotransferrin及CD28與CD80/86互作關(guān)系；對(duì)CD59的補(bǔ)體抑制活性、對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)合的主要組分進(jìn)行了研究。對(duì)中草藥當(dāng)歸、黃芪、板藍(lán)根、金銀花、甘草、山楂等10種常見(jiàn)中草藥按一定比例配制成A、B、C、D和E五種不同配方復(fù)方中草藥，通過(guò)測(cè)定羅非魚增重率、肌肉成分、血清生化指標(biāo)、血清免疫指標(biāo)、腸道菌群變化及對(duì)羅非魚抗無(wú)乳鏈球菌免疫保護(hù)力，從而篩選最佳配復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑；結(jié)果表明B配方的復(fù)方中草藥為最佳免疫增強(qiáng)劑，添加于羅非魚飼料進(jìn)行投喂后能有效提高羅非魚免疫指標(biāo)，增加羅非魚抗無(wú)乳鏈球菌免疫保護(hù)力。對(duì)篩選的B配方的復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑按1.5%添加于羅非魚飼料中采用分段法和不間斷投喂法投喂羅非魚，分析測(cè)定羅非魚增重率、肌肉成分、血清生化指標(biāo)、血清免疫指標(biāo)和腸道菌群的變化，發(fā)現(xiàn)在羅非魚養(yǎng)殖中采用分段法投喂中草藥免疫增強(qiáng)劑是一種實(shí)用的措施；將0.5%、1.0%、1.5%和2.0%含量的復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑添加至基礎(chǔ)料中分別投喂羅非魚，測(cè)定羅非魚血清中SOD活力、POD活力、PO活力、LZM活性、血清抗菌活力、MDA含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力、谷草轉(zhuǎn)氨酶活力、甘油三酯含量、總膽固醇含量的變化。羅非魚頭腎、脾臟、肝臟、腮、胸腺中IL-1β和TNF-α表達(dá)模式變化，羅非魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，羅非魚肝體比變化，羅非魚肝臟脂肪含量和肌肉脂肪含量變化，羅非魚免疫保護(hù)力的變化和羅非魚肝臟組織病理學(xué)變化。發(fā)現(xiàn)不同含量的中草藥免疫增強(qiáng)劑飼料投喂羅非魚后均能顯著提高羅非魚免疫力、促進(jìn)腸道菌群微生態(tài)平衡、降低肝臟脂肪含量和肌肉脂肪含量、保護(hù)羅非魚肝臟和提高羅非魚對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抵抗能力，其中以1.0%中草藥免疫增強(qiáng)劑對(duì)羅非魚肝臟組織保護(hù)、抵抗無(wú)乳鏈球菌的感染效果最好，最終篩選出中草藥添加劑按1.0%添加于羅非魚飼料為最佳中草藥免疫增強(qiáng)劑添加量。為探究本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的用于改善羅非魚肌肉品質(zhì)和增強(qiáng)對(duì)鏈球菌病抵抗力的中草藥免疫增強(qiáng)劑在羅非魚養(yǎng)殖中使用的安全性，我們?cè)O(shè)計(jì)中草藥免疫增強(qiáng)劑對(duì)小鼠的急性毒性、亞急性毒性和養(yǎng)殖羅非魚亞急性毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中草藥免疫增強(qiáng)劑在飼料中的添加劑量在3%以下時(shí)在羅非魚的養(yǎng)殖中使用是安全的，為該中草藥免疫增強(qiáng)劑在羅非魚養(yǎng)殖實(shí)踐應(yīng)用中提供理論依據(jù)。中草藥免疫增強(qiáng)劑的使用能有效控制羅非魚鏈球菌病，從而減少化學(xué)藥物的使用，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，提高水產(chǎn)品的質(zhì)量，使水產(chǎn)品養(yǎng)殖和出口的規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大，產(chǎn)生良好的社會(huì)效益及生態(tài)效益。三、增產(chǎn)增效情況2013年-2017年，本課題組研制的中草藥免疫增強(qiáng)劑在高州市石鼓鎮(zhèn)、鎮(zhèn)江鎮(zhèn)等地的羅非魚養(yǎng)殖廠、高州市龍灣水庫(kù)和四方田水庫(kù)、雷州市溪南水庫(kù)等地開(kāi)展羅非魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用示范，5年來(lái)建設(shè)應(yīng)用示范點(diǎn)和示范對(duì)照點(diǎn)各5個(gè)，示范面積累計(jì)共達(dá)到18400畝，其中應(yīng)用示范面積13200畝，示范對(duì)照面積5200畝，取得經(jīng)濟(jì)效益總計(jì)17039.22萬(wàn)元。更重要的是2013年和2017年因示范區(qū)暴發(fā)羅非魚鏈球菌病，示范對(duì)照點(diǎn)的未投喂中草藥免疫增強(qiáng)劑的羅非魚因需防控該病而使用了化學(xué)藥物來(lái)調(diào)水和治病，給周邊的生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了一定的隱患，而中草藥免疫增強(qiáng)劑的使用不僅在有效控制羅非魚鏈球菌病這個(gè)養(yǎng)殖瓶頸上發(fā)揮重要的作用，而且中草藥免疫增強(qiáng)劑的使用能顯著減少化學(xué)藥物的使用，提高養(yǎng)殖的成活率，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，提高水產(chǎn)品的質(zhì)量，使水產(chǎn)品養(yǎng)殖和出口的規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大，具有廣闊的市場(chǎng)前景，因此中草藥免疫增強(qiáng)劑的推廣應(yīng)用將推動(dòng)羅非魚養(yǎng)殖業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，產(chǎn)生良好的社會(huì)效益及生態(tài)效益。四、技術(shù)要點(diǎn)確定了引起我國(guó)南方羅非魚鏈球菌病的病原為無(wú)乳鏈球菌，系統(tǒng)闡述無(wú)乳鏈球菌的生物學(xué)特性和羅非魚體液免疫與細(xì)胞免疫在鏈球菌感染中的作用，并結(jié)合上述研究，研制了針對(duì)羅非魚鏈球菌病的中草藥免疫增強(qiáng)劑并應(yīng)用示范，達(dá)到了國(guó)際領(lǐng)先水平，具體技術(shù)要點(diǎn)如下：1.系統(tǒng)闡述了無(wú)乳鏈球菌的生物學(xué)特性和致病機(jī)制：研究了無(wú)乳鏈球菌致病性、耐藥性、基因分型、基因組等生物學(xué)特性，并從分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)多個(gè)角度研究了重要毒力因子功能，從而深入闡述無(wú)乳鏈球菌的致病機(jī)制。2．系統(tǒng)闡明了無(wú)乳鏈球菌感染羅非魚過(guò)程中的宿主免疫反應(yīng)分子機(jī)理：研究了羅非魚免疫因子在鏈球菌感染中的作用，并對(duì)部分因子的作用機(jī)理以及不同因子間的互作模式進(jìn)行了解析，闡明了羅非魚免疫相關(guān)分子抗病機(jī)理。3．研制了中草藥免疫增強(qiáng)劑用于羅非魚鏈球菌病的防治：在國(guó)內(nèi)首先成功研制了針對(duì)羅非魚鏈球菌病的中草藥免疫增強(qiáng)劑，采用分段投喂的方式可提升羅非魚的免疫力、促進(jìn)腸道菌群微生態(tài)平衡、降低肝臟脂肪含量和肌肉脂肪含量、保護(hù)羅非魚肝臟和提高羅非魚的抗病力，經(jīng)濟(jì)效益顯著。五、推廣情況2013年-2017年，本技術(shù)中的中草藥免疫增強(qiáng)劑在高州市石鼓鎮(zhèn)、鎮(zhèn)江鎮(zhèn)等地的羅非魚養(yǎng)殖廠、高州市龍灣水庫(kù)和四方田水庫(kù)、雷州市溪南水庫(kù)等地開(kāi)展羅非魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用示范。5年來(lái)建設(shè)應(yīng)用示范點(diǎn)和示范對(duì)照點(diǎn)各5個(gè)，示范面積累計(jì)共達(dá)到18400畝，其中應(yīng)用示范面積13200畝，示范對(duì)照面積5200畝。中草藥免疫增強(qiáng)劑在羅非魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用示范結(jié)果表明，在所有應(yīng)用示范點(diǎn)中，羅非魚成活率均超過(guò)95%，而示范對(duì)照點(diǎn)羅非魚成活率最高僅為92.08%；所有應(yīng)用示范點(diǎn)體重超過(guò)500g的魚占比超過(guò)91.8%，而示范對(duì)照最高僅為86.27%。在2013年和2017年，應(yīng)用示范區(qū)暴發(fā)了由無(wú)乳鏈球菌引起的鏈球菌病，示范對(duì)照點(diǎn)在使用化學(xué)藥物的情況下均有超過(guò)10%的魚死亡，而應(yīng)用示范點(diǎn)在沒(méi)有使用化學(xué)藥物情況下養(yǎng)殖成活率卻均高達(dá)95%以上，這表明中草藥免疫增強(qiáng)劑在羅非