Ni填料純化His標(biāo)簽蛋白的應(yīng)用案例及關(guān)鍵點(diǎn)

第第頁Ni填料純化His標(biāo)簽蛋白的應(yīng)用案例及關(guān)鍵點(diǎn)His標(biāo)簽由于其分子量小、與金屬離子結(jié)合本領(lǐng)強(qiáng)以及在變性條件下也可保持與介質(zhì)結(jié)合的特性，已成為常用的親和標(biāo)簽。固定化金屬離子親和層析（IMAC）原理為：暴露在蛋白質(zhì)表面的某些氨基酸側(cè)鏈（重要是His，及少量的Cys和Trp），可與過渡金屬離子之間發(fā)生特定的可逆性相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對蛋白的分別純化。金屬離子通常為Zn2+、Ni2+、Cu2+或Co2+，如今用Ni2+固定化金屬離子親和層析已成為純化組氨酸標(biāo)簽蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法。蛋白質(zhì)/肽與固定化金屬離子相互作用的強(qiáng)度取決于氨基酸側(cè)鏈的類型、數(shù)量和空間分布，以及所使用的金屬離子的性質(zhì)。常見的Ni螯合方式：Ni填料在獸用亞單位疫苗的應(yīng)用基因工程亞單位疫苗，在表達(dá)載體序列中加入His—tag標(biāo)簽以實(shí)現(xiàn)快速層析純化獲得目標(biāo)蛋白，發(fā)酵培養(yǎng)后通過金屬螯合親和層析填料NiChromstarFF或NiChromstarExcel一步層析純化即可獲得較高純度的目標(biāo)蛋白，經(jīng)PuredexG—25M或UF/DF進(jìn)行緩沖液置換即可進(jìn)行制劑配苗。典型案例：百林科Ni填料在重組亞單位疫苗的應(yīng)用：某獸用亞單位疫苗案例由圖可知，發(fā)酵后菌體碎裂澄清后經(jīng)一步Ni填料親和層析純化后，目標(biāo)蛋白純度高，后續(xù)經(jīng)濃縮與換液后即可進(jìn)行后續(xù)制劑配苗。典型案例：百林科Ni填料在重組膠原蛋白的應(yīng)用：大腸表達(dá)的重組膠原蛋白應(yīng)用案例由圖可知，重組膠原蛋白經(jīng)一步NiChromstarFF純化后可得較高純度蛋白洗脫液，后續(xù)經(jīng)PuredexG—25M脫鹽換液后再進(jìn)行離子交換層析精純可得高純度重組膠原蛋白。不同Ni螯合方式純化效果對比（另一重組膠原蛋白）1、NiChromstarFF與NiChromstarExcel均可用于純化重組膠原蛋白；2、NiChromstarExcel洗脫純度明顯較NiChromstarFF高，對于雜質(zhì)的去除有顯著的改善效應(yīng)。鑒于以上情況，Ni親和填料在各種重組蛋白項(xiàng)目上應(yīng)用較多，而試驗(yàn)中也會常常遇到各種問題，該如何解決吶？以下匯總了常見問題以及對應(yīng)解決方法：01His標(biāo)簽蛋白與親和介質(zhì)不結(jié)合①His標(biāo)簽未翻譯表達(dá)解決思路：使用Westernblot方法檢測His標(biāo)簽是否表達(dá)重新構(gòu)建目的蛋白分子，轉(zhuǎn)變插入His標(biāo)簽的位置（C端或N端）②His標(biāo)簽暴露不充分解決思路：向樣品中加入肯定量變性劑（如：3～8M尿素，3～6M鹽酸胍等），再上樣純化重新構(gòu)建目的蛋白分子，適當(dāng)加添組氨酸基團(tuán)個(gè)數(shù)，或在His標(biāo)簽與目的蛋白之間加入一段Linker02His標(biāo)簽蛋白純化后純度低①介質(zhì)的離子交換作用，導(dǎo)致了非特異結(jié)合解決思路：在平衡液、樣品、洗脫液中，加入0.5MNaCl，屏蔽介質(zhì)的離子交換作用②雜蛋白也能與金屬離子結(jié)合解決思路：調(diào)整樣品與介質(zhì)的結(jié)合條件，譬如預(yù)先在樣品及平衡液中加入10～50mM咪唑，屏蔽與介質(zhì)弱結(jié)合的蛋白洗脫過程采用梯度洗脫方法，摸索最佳純度條件試驗(yàn)其他金屬離子螯合親和層析介質(zhì)在目的蛋白分子上額外構(gòu)建一個(gè)蛋白標(biāo)簽，如：GST標(biāo)簽，兩步純化目的蛋白，或銜接其他純化方法進(jìn)一步純化③His標(biāo)簽蛋白被降解解決思路：細(xì)胞碎裂過程中釋放的蛋白酶可能會降解目的蛋白，導(dǎo)致帶有His標(biāo)簽的小片段產(chǎn)生，形成產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，可以在處理樣品過程中加入肯定量蛋白酶抑制劑假如目的蛋白自身不穩(wěn)定，會發(fā)生降解，則需要摸索維持目的蛋白穩(wěn)定的最佳條件，包含溫度、緩沖液成分和操作時(shí)間等03His標(biāo)簽蛋白無法洗脫①目的蛋白與介質(zhì)結(jié)合本領(lǐng)過強(qiáng)解決思路：進(jìn)一步加添洗脫咪唑濃度，或同時(shí)適當(dāng)降低pH值通過脫落金屬離子，進(jìn)行洗脫，可用pH值3.5條件或EDTA進(jìn)行洗脫②目的蛋白沉淀在層析柱內(nèi)解決思路：摸索維持目的蛋白穩(wěn)定的最佳條件，包含溫度、緩沖液成分和操作時(shí)間等適當(dāng)降低上樣量用變性劑洗脫，如8M尿素或6M鹽酸胍04層析介質(zhì)變色①介質(zhì)長期使用，顯現(xiàn)白色解決思路：假如介質(zhì)長期使用，或單次使用上樣量較大時(shí)，會導(dǎo)致介質(zhì)金屬離子脫落，從而導(dǎo)致介質(zhì)變白，可通過介質(zhì)再生解決假如介質(zhì)表面結(jié)合了大量目的蛋白，在純化過程中，會略顯白色，洗脫后顏色會恢復(fù)，屬于正常現(xiàn)象②介質(zhì)在純化過程中，顯現(xiàn)棕色解決思路：介質(zhì)在純化過程中變成棕色，重要是受緩沖液或樣品中還原劑的影響，可以選擇去掉還原劑成分，或者使用NiChromstarExcel介質(zhì)③介質(zhì)長期使用過程中，顯現(xiàn)黃色介質(zhì)在使用過程中，會積累非特異性吸附的雜質(zhì)，包含蛋白、色素等。同時(shí)在層析柱頂端也會積累沉淀蛋白，長期使用后，就會顯現(xiàn)介質(zhì)頂端發(fā)黃的現(xiàn)象。