食品中葉酸的測定 預(yù)包被微孔板式微生物法

1食品中葉酸的測定預(yù)包被微孔板式微生物法1范圍本文件規(guī)定了食品中葉酸測定的預(yù)包被微孔板式微生物法。本文件適用于飲料、糖果、調(diào)制乳粉、嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、保健食品、谷物及其制品、蛋類和乳類食品中葉酸含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3原理葉酸是預(yù)包被微孔板中鼠李糖乳桿菌(Lactobacilluscaseispp.rhamnosus,ATCC7469)生長所必需的營養(yǎng)素。在一定控制條件下,在葉酸測定培養(yǎng)基中,鼠李糖乳桿菌的生長與待測試樣中葉酸的含量呈線性關(guān)系,將吸光度與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較,即可計(jì)算出試樣中葉酸的含量。4試劑和材料4.1試劑4.1.1預(yù)包被微孔板式葉酸微生物法試劑盒(VitaFastFolicAcid):見附錄A。4.1.2除非另有規(guī)定,本方法所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水要求。4.1.3氫氧化鈉(NaOH)。4.1.4雞胰酶(γ-谷氨酰水解酶)(VitaFastChickenPancreatin)。4.1.5磷酸二氫鈉(NaH2PO4)。4.1.6抗壞血酸鈉(C6H7O6Na)。4.2試劑配制4.2.11mol/L氫氧化鈉:稱量4.00g氫氧化鈉,加水溶解后,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,加水定容至刻度。4.2.2磷酸鹽緩沖液:稱量7.80g磷酸二氫鈉和1.00g抗壞血酸鈉,加水溶解后,轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中,加水定容至刻度。用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2,現(xiàn)用現(xiàn)配。4.2.3雞胰酶液:加入5mL水至雞胰酶試劑瓶中,混合均勻?？煞盅b保存,每個(gè)樣品測定使用100μL。5儀器和設(shè)備5.1水浴鍋:95℃±1℃,37℃±1℃。25.2恒溫培養(yǎng)箱:37℃±1℃。5.3均質(zhì)器。5.4超凈工作臺(tái)。5.5離心機(jī):≥8000g。5.6酶標(biāo)儀:波長610nm~630nm或540nm~550nm。5.7渦旋混合器。5.8電子天平:感量0.01g。5.9微量可調(diào)單通道移液器及配套槍頭:10μL~100μL、50μL~200μL、100μL~1000μL。5.10無菌離心管:1.5mL~2mL、15mL、50mL。5.11錐形瓶:500mL。5.12容量瓶:100mL和1000mL。5.13無菌注射器:10mL。5.14無菌聚醚砜濾膜(PES):0.22μm。6分析步驟6.1試樣制備固體試樣需粉碎、研磨、過篩(篩板孔徑0.3mm~0.5mm);半固體試樣需混勻;液體試樣需振搖混勻。6.2試樣提取6.2.1飲料準(zhǔn)確稱量固體試樣1.00g或移取液體試樣1mL至50mL無菌離心管中,加水至40mL,渦旋混勻后,試樣溶液用無菌注射器和無菌聚醚砜濾膜無菌過濾至2mL無菌離心管中。此為稀釋倍數(shù)為40的樣品液。6.2.2糖果準(zhǔn)確稱量1.00g試樣至50mL無菌離心管中,加水至40mL,渦旋混勻后,置于95℃水浴30min,使試樣溶解,其間顛倒混勻至少5次,確保離心管緊閉。水浴結(jié)束后,置于冰浴迅速冷卻到30℃以下,試樣溶液用無菌注射器和無菌聚醚砜濾膜無菌過濾至2mL無菌離心管中。此為稀釋倍數(shù)為40的樣品液。6.2.3調(diào)制乳粉、嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品準(zhǔn)確稱量1.00g試樣至50mL無菌離心管中,加按4.2.2方法配制的磷酸鹽緩沖液至40mL,渦旋混勻后,置于95℃水浴30min,其間顛倒混勻至少5次,并確保離心管緊閉。水浴結(jié)束后,置于冰浴迅速冷卻到30℃以下,試樣溶液用無菌注射器和無菌聚醚砜濾膜無菌過濾至2mL無菌離心管中。此為稀釋倍數(shù)為40的樣品液。6.2.4保健食品準(zhǔn)確稱量1.00g試樣至500mL錐形瓶中,加入400mL按4.2.2方法配制的磷酸鹽緩沖液,混合均勻后,置于95℃水浴30min,其間搖勻至少5次。水浴結(jié)束后,置于冰浴迅速冷卻到30℃以下。將全部溶液轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中,加水定容至刻度。取1mL溶液至50mL無菌離心管中,加水至40mL,渦旋混勻,試樣溶液用無菌注射器和無菌聚醚砜濾膜無菌過濾至2mL無菌離心管中。此為稀釋倍數(shù)為40000的樣品液。若葉酸含量較低,可適當(dāng)調(diào)整定容體積。36.2.5谷物及其制品、蛋類和乳類食品準(zhǔn)確稱量1.00g試樣至50mL無菌離心管中,加入100μL按4.2.3配制的雞胰酶液,再加入按4.2.2方法配制的磷酸鹽緩沖液至40mL。在37℃黑暗條件下孵育2h(其間不時(shí)振蕩)。對(duì)于谷物制品孵育時(shí)間不少于12h或者過夜處理。之后,置于95℃水浴提取30min,其間顛倒混勻至少5次,并確保離心管緊閉。水浴結(jié)束后,置于冰浴迅速冷卻至30℃以下。室溫(20℃~25℃)條件下8000g離心5min,取上清液。此為稀釋倍數(shù)為40的樣品液。6.3樣品液稀釋按照試樣的葉酸標(biāo)簽值及標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍,用無菌蒸餾水(見附錄A.1)對(duì)樣品液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使稀釋后樣品液中的葉酸含量落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。樣品液稀釋時(shí)應(yīng)逐級(jí)稀釋,注意每次稀釋倍數(shù)不應(yīng)大于10。6.4培養(yǎng)基制備用10mL無菌蒸餾水(見附錄A.1)溶解測定葉酸的干粉培養(yǎng)基(見附錄A.1),并加入1mL葉酸緩沖液(見附錄A.1),蓋緊瓶蓋,渦旋振蕩混勻。置于95℃水浴5min,其間顛倒混勻至少2次。水浴結(jié)束后,置于冰浴迅速冷卻到30℃以下。用無菌注射器和無菌聚醚砜濾膜對(duì)培養(yǎng)基溶液進(jìn)行無菌過濾,置于15mL無菌離心管待用,現(xiàn)用現(xiàn)配。6.5標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液的配制根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)簽說明,在標(biāo)準(zhǔn)品中加入相應(yīng)體積的無菌蒸餾水(見附錄A.1),渦旋混勻得到1.6μg/100mL標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液。根據(jù)表1進(jìn)行梯度標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液的配制,現(xiàn)用現(xiàn)配。表1梯度標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液的配制編號(hào)濃度/(μg/100mL)配制方法標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液0(Std0)0900μL無菌蒸餾水+0μL標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液1(Std1)0.16900μL無菌蒸餾水+100μL標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液2(Std2)0.32400μL無菌蒸餾水+100μL標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液3(Std3)0.64300μL無菌蒸餾水+200μL標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液4(Std4)0.96200μL無菌蒸餾水+300μL標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液5(Std5)1.28100μL無菌蒸餾水+400μL標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液6.6加樣和培養(yǎng)6.6.1加樣每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液和待測樣品都設(shè)置三平行,取出所需數(shù)量的微孔板條并在微孔板架上固定,未使用的微孔板條立即放回原來的箔袋中,并與干燥劑一起重新封好,儲(chǔ)存在2℃~8℃溫度條件下。吸取150μL無菌過濾后的葉酸培養(yǎng)基至每個(gè)微孔中。吸取150μL標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液或待測樣品液至微孔中,記錄每個(gè)微孔所加的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品的編號(hào)。根據(jù)使用微孔板條的數(shù)量,取出合適大小的黏合箔,去除黏合箔的保護(hù)膜后平放在微孔條上,用手將黏合箔壓平,使其充分封閉微孔,確保邊緣部分壓平/密封。6.6.2培養(yǎng)將密封好的微孔板置于37℃避光孵育44h~48h。46.6.3測定將微孔板倒置于桌面并緊貼桌面平行搖動(dòng),使微孔中的液體混勻。將微孔板翻轉(zhuǎn)孔口朝上靜置10s后,以對(duì)角線方向緩慢撕下黏合箔,撕下黏合箔時(shí)應(yīng)注意用手按住微孔板條邊緣,防止因黏合箔帶動(dòng)微孔條而造成微孔中液體濺出。撕下黏合箔后仔細(xì)檢查微孔中的液體,如有氣泡應(yīng)用移液器槍頭戳破或用移液器吸除。用酶標(biāo)儀于610nm~630nm或540nm~550nm波長下讀取吸光度。7繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、結(jié)果計(jì)算和結(jié)果表述7.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算梯度標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液的三平行檢測所測得的吸光度的算術(shù)平均值,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。以梯度標(biāo)準(zhǔn)品葉酸含量為橫坐標(biāo),以吸光度的平均值為縱坐標(biāo),使用RIDASOFTWin軟件的四參數(shù)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.2結(jié)果計(jì)算計(jì)算待測樣品液的三平行檢測所測得的吸光度的算術(shù)平均值,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。在標(biāo)準(zhǔn)曲線中代入待測樣品液吸光度的平均值,求得待測樣品液中葉酸的濃度。按照式(1)或式(2)求得待測樣品中葉酸的含量。固體或半固體試樣中葉酸的含量為:X=×d×V………(1)式中:X—待測樣品中葉酸的含量,單位為微克每百克(μg/100g);Cx—待測樣品液中葉酸的濃度,單位為微克每百毫升(μg/100mL);m—待測樣品的質(zhì)量,單位為克(g);40—稀釋倍數(shù)40,已經(jīng)包括在標(biāo)準(zhǔn)曲線中;d—樣品液的稀釋倍數(shù);V—定容體積,40mL。液體試樣中葉酸的含量為:X=×d×V………(2)式中:X—待測樣品中葉酸的含量,單位為微克每百毫升(μg/100mL);Cx—待測樣品液中葉酸的濃度,單位為微克每百毫升(μg/100mL);v—待測樣品的體積,單位為毫升(mL);40—稀釋倍數(shù)40,已經(jīng)包括在標(biāo)準(zhǔn)曲線中;d—樣品液的稀釋倍數(shù);V—定容體積,40mL。注1:根據(jù)6.2制備樣品液時(shí)的40倍稀釋倍數(shù)已經(jīng)包括在標(biāo)準(zhǔn)曲線中,稀釋倍數(shù)d只需考慮除此40倍以外的稀釋倍數(shù),例如6.2.4中額外的1000倍,或6.3中的稀釋倍數(shù)。注2:測定結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位有效數(shù)字。7.3結(jié)果表述7.3.1若測定的是固體樣品,葉酸含量的單位用μg/100g表示;若測定的是液體樣品,葉酸含量的單5位用μg/100mL表示。7.3.2若測定結(jié)果小于定量限0.16μg/100g(mL),則待測樣品中葉酸含量的測定結(jié)果表述為“<方法定量限”。8質(zhì)量控制8.1標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液0的吸光度應(yīng)小于標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液1的吸光度,標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液5的吸光度應(yīng)大于0.6,否則表明實(shí)驗(yàn)失敗。8.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不得低于0.99。8.3三平行的變異系數(shù)不應(yīng)大于10%。8.4當(dāng)待測樣品液的吸光度小于標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液1或大于標(biāo)準(zhǔn)稀釋工作液5的吸光度時(shí),不能使用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測樣品中葉酸的含量,需調(diào)整稀釋倍數(shù)重新檢測,使待測樣品液的吸光度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍內(nèi)。8.5不同批號(hào)試劑盒中的組分不得混用,超過有效期的試劑盒不得使用。9靈敏度本方法檢測飲料的檢出限為0.022μg/100g(mL),定量限為0.16μg/100g(mL);檢測糖果的檢出限為0.022μg/100g,定量限為0.16μg/100g;檢測調(diào)制乳粉的檢出限為0.021μg/100g,定量限為0.16μg/100g;檢測嬰幼兒配方食品的檢出限為0.022μg/100g,定量限為0.16μg/100g;檢測嬰幼兒輔助食品的檢出限為0.021μg/100g,定量限為0.16μg/100g;檢測特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的檢出限為0.022μg/100g,定量限為0.16μg/100g;檢測保健食品的檢出限為0.022μg/100g,定量限為0.16μg/100g;檢測谷物的檢出限為0.021μg/100g,定量限為0.16μg/100g;檢測谷物制品、蛋類和乳類食品的檢出限為0.022μg/100g,定量限為0.16μg/100g。6(規(guī)范性)預(yù)包被微孔板式葉酸微生物法檢測試劑盒A.1試劑盒組成預(yù)包被微孔板式葉酸微生物法檢測試劑盒VitaFastFolicAcid包括:a)包被有菌種Lactobacilluscaseispp.rhamnosus(ATCC7469)的微孔板:12×8孔;b)無菌蒸餾水: