線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）試劑盒說明書

第第頁線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）試劑盒說明書線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測定前務(wù)必取23個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：MDH（EC1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物，連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細(xì)胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、蘋果酸天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD依賴的MDH和NADP依賴的MDH，細(xì)菌中通常只含有NADMDH，在真核細(xì)胞中，NADMDH分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。測定原理：MDHm催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。試劑的組成和配制：試劑一：100mL×1瓶，20℃保存；試劑二：20mL×1瓶，20℃保存；試劑三：1.5mL×1支，20℃保存；試劑四、液體20mL×1瓶，在4℃保存；試劑五、粉劑×1瓶，20℃保存；樣本測定的準(zhǔn)備：組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：1、稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。2、將勻漿液于600g，4℃離心5min。3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。4、上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的MDH（此步可選做）。5、在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于MDHm活性測定。測定步驟：1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。2、檢測工作液的配制：用時在試劑五中加入19mL試劑四和0.5mL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融。3、測定前將檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液，混勻后立即記錄340nm處20s時的吸光值A(chǔ)1和1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1A2、MDHm活力單位的計算：a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。MDHm（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=6430×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算：單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。MDHm（nmol/min/g鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=1299×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。MDHm（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=0.65×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.005mL；V樣總：加入提取液體積，0.202mL；T：反應(yīng)時間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬。b.用96孔板測定的計算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。MDHm（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=12860×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算：單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。MDHm（nmol/min/g鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=2598×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。MDHm（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=1.3×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，