土壤磷酸酶的測定方法

土壤磷酸酶活性的測定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了土壤磷酸酶的測定方法（磷酸苯二鈉比色法）。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類土壤磷酸酶的測定（磷酸苯二鈉比色法）。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的應(yīng)用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T601化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T1121.1土壤檢測第一部分：土壤樣品的采集、處理和貯存3原理本方法以磷酸苯二鈉為基質(zhì)，在磷酸酶的作用下，基質(zhì)水解生成酚，使其與氯代二溴對苯醌亞胺試劑反應(yīng)生成藍(lán)色，顏色深度與酚含量呈正相關(guān)，用比色法測定游離的酚含量來表示磷酸酶的活性。4試劑和溶液除非另有說明外，本方法均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，分析用水為GB/T6682規(guī)定的三級水。4.1甲苯（C7H8）。4.2冰醋酸（C2H4O2）。4.3無水醋酸鈉（C2H3O2Na）。4.4檸檬酸（C6H8O7）。4.5磷酸氫二鈉（Na2HPO4）。4.6四硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）。4.7氫氧化鈉（NaOH）。4.8硫酸鋁（Al2(SO4)3）。4.9磷酸苯二鈉（C6H5Na2PO4）。4.10苯酚（C6H6O）。4.11氯代二溴對苯醌亞胺（C6H2Br2ClNO）。4.12緩沖液4.12.1醋酸鹽緩沖液（pH5.0）醋酸溶液（0.2mol/L準(zhǔn)確移取11.55mL冰醋酸用水溶解定容至1L。醋酸鈉溶液（0.2mol/L稱取16.4g（精確至0.01g）無水醋酸鈉用水溶解定容至1L。準(zhǔn)確移取14.80mL醋酸溶液（0.2mol/L）和35.20mL醋酸鈉溶液（0.2mol/L）用水定4.12.2檸檬酸鹽緩沖液（pH7.0）檸檬酸溶液（0.1mol/L稱取19.2g（精確至0.01g）檸檬酸，用水溶解定容至1L。磷酸氫二鈉溶液（0.2mol/L稱取53.63g（精確至0.01g）七水合磷酸氫二鈉或71.70g十二水合磷酸氫二鈉，用水溶解定容至1L。準(zhǔn)確移取6.40mL0.1mol/L檸檬酸溶液加43.60mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液，用水定4.12.3硼酸鹽緩沖液（pH9.6）硼砂溶液（0.05mol/L稱取19.05g（精確至0.01g）四硼酸鈉，用水溶解定容至1L。氫氧化鈉溶液（0.2mol/L稱取8g（精確至0.01g）氫氧化鈉，用水溶解定容至1L。準(zhǔn)確量取50mL硼砂溶液（0.05mol/L）加23mL氫氧化鈉溶液（0.2mol/L）用水定容4.13磷酸苯二鈉溶液（5g/L）或硼酸鹽緩沖液（4.12.3）溶解定容至1L。4.14氯代二溴對苯醌亞胺試劑稱取0.125g（精確至0.0001g）氯代二溴對苯醌亞胺，用10mL96%乙醇溶解，貯于棕色瓶中，放冰箱4℃冷藏保存。溶液顏色未變褐色之前均可使用。4.15硫酸鋁溶液（3g/L）稱取3g（精確至0.01g）硫酸鋁，用水溶解定容至1L。4.16酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/mL）4.16.1酚儲備液準(zhǔn)確稱取1g（精確至0.0001g）苯酚（4.10）溶于水中，定容至1L，存于棕色瓶中。4.16.2酚工作液（0.01mg/ml）準(zhǔn)確移取10.00mL酚儲備液（4.16.1用水定容至1L。5儀器設(shè)備5.1電子天平：感量0.0001g和0.01g。5.2恒溫培養(yǎng)箱（37℃±1℃)。5.3分光光度計(jì)（660nm）。6分析步驟準(zhǔn)確稱取5g（精確至0.0001g）土樣（如含量高可適當(dāng)減少稱樣量）置于100mL具塞三角瓶中，加入2.5mL甲苯（4.1輕搖15min后，加入20mL5g/L磷酸苯二鈉溶液（4.13仔細(xì)搖勻后放入恒溫培養(yǎng)箱，37℃±1℃下培養(yǎng)24h后取出，在培養(yǎng)液加入100mL3g/L硫酸鋁溶液（4.15）搖勻，并過濾。準(zhǔn)確吸取3.00mL濾液于50mL容量瓶中，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色，呈現(xiàn)藍(lán)色，于分光光度計(jì)660nm處比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確吸取0.00、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00、13.00mL酚工作液（4.16.2置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL緩沖液（4.12）和4滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑（4.14顯色后用水稀釋定容至刻度，配成濃度為0.0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6ug/mL的一組標(biāo)準(zhǔn)濃度。30min后，于分光光度計(jì)上660nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注:①每個樣品應(yīng)該做一個無基質(zhì)對照，以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。②整個實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。③如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。7、結(jié)果計(jì)算磷酸酶活性以24h，1g風(fēng)干土壤可水解生成酚的量（mg）表示，按式（1）計(jì)算：式中：X樣品中磷酸酶的含量，單位為毫克每克每24小時（mg/g·24hC1樣品加基質(zhì)吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚含量，單位為微克每毫升（ug/mLC2樣品未加基質(zhì)吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚含量，單位為微克每毫升（ug/mLV顯色液定容體積，單位為微升（mLN為分