土壤脲酶的測定方法

土壤脲酶的測定（苯酚鈉—次氯酸鈉比色法）本標準規(guī)定了土壤脲酶的測定方法（苯酚鈉—次氯酸鈉比色法）。本標準適用于各類土壤脲酶的測定（苯酚鈉—次氯酸鈉比色法）。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的應用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T601化學試劑標準滴定溶液的制備GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T1121.1土壤檢測第一部分：土壤樣品的采集、處理和貯存3原理土壤中脲酶活性的測定是以尿素為基質(zhì)，經(jīng)土壤脲酶酶促基質(zhì)水解生成氨，氨與苯酚—次氯酸鈉在常溫條件下作用生成藍色靛酚，顏色深度與生成氨的量呈正比，用比色法測定氨的量來表示脲酶活性。4試劑和溶液除非另有說明外，本方法均使用符合國家標準的分析純試劑，分析用水為GB/T6682規(guī)定的三級水。4.1甲苯（C7H8）。4.2尿素（CON2H4）。4.3檸檬酸（C6H8O7）。4.4氫氧化鉀（KOH）。4.5苯酚鈉（C6H5ONa）。4.6次氯酸鈉溶液根據(jù)市售次氯酸鈉溶液濃度稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%。4.7尿素溶液（100g/L）稱取10g（精確至0.01g）尿素，用水溶解，定容至100mL。4.8檸檬酸鹽緩沖液（pH6.7）稱取184g（精確至0.01g）檸檬酸和147.50g氫氧化鉀各溶于水中，將兩溶液合并，用1mol/L氫氧化鈉將pH調(diào)至6.7，用水定容至1000mL。4.9苯酚鈉溶液（1.35mol/L）稱取62.5g（精確至0.01g）苯酚鈉溶于少量乙醇，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，用乙醇定容至100mL（A液）；稱取27g（精確至0.01g）氫氧化鈉，用水溶解后定容至100mL（B液）。將A、B溶液保存在4℃冰箱中。使用前將A液、B液各20mL混合，用水定容至100mL。4.10氨的標準溶液精確稱取0.4717g（精確至0.0001g）經(jīng)干燥箱105℃烘干3h硫酸銨溶于水并定容至1000mL，得到1mL含有0.1mg氨的儲備溶液。使用前將上述溶液用水稀釋10倍，配制成濃度為0.01mg/mL的工作液。5儀器設備5.1電子天平：感量0.0001g和0.01g。5.2恒溫培養(yǎng)箱（37℃±1℃)。5.3分光光度計（578nm）。6分析步驟稱取5g土樣（精確至0.0001g如含量高可適當減少稱樣量）于100mL具塞三角瓶中，加入1mL甲苯（4.1），振蕩均勻，15min后加入10mL100g/L尿素溶液（4.7）和20mLpH6.7檸檬酸鹽緩沖溶液（4.8），搖勻后在37℃±1℃恒溫箱培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后過濾，過濾后吸取1.00mL濾液至50mL容量瓶中，再依次加入4mL苯酚鈉溶液（4.9）和3mL次氯酸鈉溶液（4.6），邊加邊搖勻。20min后顯色，用水定容至50mL。1h內(nèi)在分光光度計578nm波長處比色。（靛酚的藍色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）。11.00、13.00mL工作液（4.10），移于50mL容量瓶中，然后加水20mL。再依次加入4mL苯酚鈉溶液（4.9）和3mL次氯酸鈉溶液（4.6），邊加邊搖勻。20min后顯色，定容，配成濃度為0.0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6ug/mL的一組標準濃度。1h內(nèi)在分光光度計578nm波長處比色。然后以氨濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。注意事項:①每一個樣品應做一個無基質(zhì)對照，以等體積的水代替基質(zhì)（100g/L尿素水溶液其他操作與樣品實驗相同，以排除土樣中原有的氨對實驗結(jié)果的影響。②整個實驗設置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實驗相同，以檢驗試劑純度和基質(zhì)自身分解，即空白試驗。③如果樣品吸光值超過標曲的最大值，則應該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。7結(jié)果計算脲酶活性以24h，1g風干土壤可水解生成氨量的毫克數(shù)表示，按式（1）計算：式中：X樣品中脲酶的含量（mg/g·24h）；C1樣品加基質(zhì)吸光值由標準曲線求得的氨量（ug/mL）；C2樣品未加基質(zhì)吸光值由標準曲線求得的氨量（ug/mL）；V顯色定容體積（mL）；N為分取倍數(shù)=浸出液體積