化妝品中聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉等5種原料的檢驗(yàn)方法

附件8化妝品中聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉等5種原料的檢驗(yàn)方法Disodiumdistyrylbiphenyldisulfonateandother4kindsofcomponentsincosmetic1范圍本方法規(guī)定了高效液相色譜-熒光檢測器法測定聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉等5種原料的含量。本方法適用于面膜、化妝水、護(hù)膚乳、護(hù)膚霜類型化妝品中聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉等5種原料含量的測定。本方法所指的5種原料包括聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉、4,4'-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽、二乙氨基甲基香豆素、二苯并噁唑基萘、雙（叔丁基苯并噁唑基）噻吩。2方法提要樣品處理后，經(jīng)高效液相色譜儀分離，熒光檢測器檢測，根據(jù)保留時(shí)間定性，峰面積定量，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，對于測定過程中有陽性結(jié)果的樣品，采用液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性確證。本方法中各原料的檢出限、定量下限及取樣量為0.5g時(shí)的檢出濃度和最低定量濃度見表1。表15種原料的檢出限、定量下限、檢出濃度和最低定量濃度名稱檢出限（ng）定量下限（ng）檢出濃度(μg/g)最低定量濃度(μg/g)4,4'-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽0.040.11.64聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉0.0050.020.20.8二乙氨基甲基香豆素0.0050.020.20.8二苯并噁唑基萘0.0030.010.120.4雙（叔丁基苯并噁唑基）噻吩0.0030.010.120.43試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純或以上規(guī)格，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。3.1乙腈，色譜純。3.2氨水，優(yōu)級純，含量（NH3）=25%～28%。3.3乙酸銨，色譜純。3.4N，N-二甲基甲酰胺（DMF），色譜純。3.5流動相的配制：流動相A:25mmol/L乙酸銨溶液，用氨水調(diào)節(jié)pH至8.0，過濾。流動相B:乙腈。3.6混合溶劑：70%25mmol/L乙酸銨溶液（用氨水調(diào)節(jié)pH至8.0）+30%乙腈。3.7標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱4,4'-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽、聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉、二乙氨基甲基香豆素、二苯并噁唑基萘、雙（叔丁基苯并噁唑基）噻吩標(biāo)準(zhǔn)品各10mg（精確到0.00001g）分別置于50mL容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺（3.4）使溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.2mg/mL的各原料儲備溶液。儲備溶液避光保存于0℃-4℃冰箱中，應(yīng)于2天內(nèi)使用。分別精密量取4,4'-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽儲備溶液5.00mL、聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉、二乙氨基甲基香豆素、二苯并噁唑基萘、雙（叔丁基苯并噁唑基）噻吩儲備溶液各0.50mL置于同一100mL容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺（3.4）稀釋至刻度，搖勻，再精密量取上述溶液2.5mL置于50mL容量瓶，加混合溶劑（3.6）稀釋至刻度，搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲備溶液避光保存于0℃-4℃冰箱中，應(yīng)于2天內(nèi)使用。4儀器和設(shè)備4.1高效液相色譜儀，熒光檢測器。4.2液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。4.3天平。4.4超聲波清洗儀。4.5高速離心機(jī)。4.6渦旋振蕩器。4.7pH計(jì)：精度0.01。5分析步驟5.1混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（3.7）0.20mL、0.40mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、10.00mL于10mL容量瓶中，用混合溶劑（3.6）稀釋至刻度，制得混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。5.2樣品處理稱取樣品0.5g（精確到0.001g），置于10mL具塞比色管中，加入N，N-二甲基甲酰胺（3.4）定容至刻度，渦旋60s，混勻，超聲提取20min，以10000r/min離心10min，精密量取上清液0.50mL于10mL具塞比色管中，加混合溶劑（3.6）定容至刻度，作為待測溶液，避光保存于0℃-4℃冰箱中，應(yīng)于1天內(nèi)測定。注：（1）面膜類樣品只取內(nèi)容物。（2）高濃度的聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉會對高效液相進(jìn)樣系統(tǒng)產(chǎn)生污染，在實(shí)驗(yàn)之前可對樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，即在紫外燈366nm處，觀察熒光情況，如熒光強(qiáng)度高，則在進(jìn)樣前做稀釋處理。5.3參考色譜條件色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5m），或等效色譜柱；表2流動相梯度洗脫程序時(shí)間/minV(流動相A）/%V(流動相B）/%0.00703010.00703016.00109020.00109020.0129838.0029840.00703045.007030流速：1.0mL/min；激發(fā)波長：360nm；發(fā)射波長：440nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。5.4測定在“5.3”色譜條件下，取混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.1）濃度從低到高分別進(jìn)樣，進(jìn)行液相色譜分析，分別以混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取“5.2”項(xiàng)下的待測溶液進(jìn)樣，根據(jù)保留時(shí)間定性，測得峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測溶液中各原料的濃度。按“6”分別計(jì)算樣品中5種原料的含量。6分析結(jié)果的表述6.1計(jì)算w=D′r′Vm′1000式中：ω——化妝品中聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉等5種原料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/g；r——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到待測原料的質(zhì)量濃度，ng/mL；V——樣品定容體積，mL；m——樣品稱樣量，g；D——稀釋倍數(shù)（不稀釋則取1）。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。6.2回收率和精密度多家實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證在定量下限濃度附近回收率為76.0%～128.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于7.3%；其他濃度回收率為82.0%～119.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于5.5%。7圖譜圖1混標(biāo)溶液色譜圖1：4,4'-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽（566.9ng/mL）；2：聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉（59.51ng/mL）；3：二乙氨基甲基香豆素（74.97ng/mL）；4：二苯并噁唑基萘（54.64ng/mL）；5：雙（叔丁基苯并噁唑基）噻吩（58.41ng/mL）附錄A(規(guī)范性附錄)聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉等5種原料的陽性結(jié)果確證如檢出陽性樣品，需經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性確證。A.1前處理過程見“5.2”A.2參考色譜條件色譜柱：C18柱（2.1mm×50mm，1.8μm)，或等效色譜柱；流動相A:10mmol/L乙酸銨溶液流動相B:乙腈表A.1梯度洗脫程序時(shí)間/minV(流動相A）/%V(流動相B）/%0.0190105109010109010.19010129010流量：0.4mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：1μL。A.3參考質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；A.3.14,4'-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽、聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉掃描方式：負(fù)離子掃描；離子源溫度：550℃；氣簾氣：20psi；電離電壓：-4500V；噴霧氣：55psi；輔助加熱氣：55psi；碰撞氣：7psi；A.3.2二乙氨基甲基香豆素、雙（叔丁基苯并噁唑基）噻吩、二苯并噁唑基萘掃描方式：正離子掃描；離子源溫度：550℃；氣簾氣：20psi；電離電壓：5500V；噴霧氣：55psi；輔助加熱氣：55psi；碰撞氣：7psi；表A.2母離子、特征碎片離子、去簇電壓及碰撞能編號原料名稱母離子（m/z）特征碎片離子（m/z）去簇電壓（V）碰撞能(V)14,4'-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽413.2310.8*-205-31271.2-205-352聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉258.2226.0*-125-2579.8-125-333二乙氨基甲基香豆素232.1188.1*15036203.1150244雙（叔丁基苯并噁唑基）噻吩431.3415.2*220555二苯并噁唑基萘363.1401.222054270.0*20045244.120051*作為定量離子A.4定性判定在相同的試驗(yàn)條件下，樣品中應(yīng)呈現(xiàn)定量離子對和定性離子對的色譜峰、被測原料的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)原料的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間一致，樣品色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子對的相對豐度相比的偏差不超過表A.3規(guī)定范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的測定原料。表A.3定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度（k）k>50%50%≥k>20%20%≥k>10%k≤10%允許的最大偏差±20%±25%±30%±50%A.5檢出限本方法4,4'-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽的檢出濃度為11μg/g，聯(lián)苯乙烯二苯基二磺酸二鈉的檢出濃度為0.07μg/g，二乙氨基甲基香豆素的檢出濃度為0.02μg/g，雙（叔丁基苯并噁唑基）噻吩的檢出濃度為0.2μg/g，二苯并噁唑基萘的檢出濃度為0.2μg/g。A.6圖譜85#185#1(413.2/310.8Da)圖A.14,4'-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽圖譜（2.158ng/mL）351#1351#1(25