2.基因工程課件

2第二章基因工程本章學(xué)習(xí)目的：

學(xué)習(xí)基因工程基本原理和基本操作過程,為進一步學(xué)習(xí)生物技術(shù)相關(guān)知識和從事基因工程工作打下基礎(chǔ)。

2.1基因工程概況

2.1.1基因工程的基本含義

按照人們的愿望（人為的），進行嚴密的設(shè)計（類似工程設(shè)計），通過體外DNA重組（非生命活動過程）和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有的物種在較短的時間內(nèi)趨于完善（區(qū)別于自然突變和常規(guī)育種），創(chuàng)造出更符合人們需求的新的生物類型;利用這種技術(shù)對人類疾病進行有效的診斷和治療。2.1.2基因工程的主要理論依據(jù)不同基因具有相同的遺傳物質(zhì)(DNA/RNA)基因是可以從DNA上切割下來的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系遺傳密碼是通用的(絕少數(shù)除外)可以通過DNA復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代

2.1基因工程概況

編碼氨基酸的通用遺傳密碼子第一位（5′端）第二位（中間）第三位（3′端）UCAG

U苯丙氨酸Phe絲氨酸Ser酪氨酸Tyr半胱氨酸CysU苯丙氨酸Phe絲氨酸Ser酪氨酸Tyr半胱氨酸CysC亮氨酸Leu絲氨酸Ser終止stop終止stopA亮氨酸Leu絲氨酸Ser終止stop色氨酸TrpG

C亮氨酸Leu脯氨酸Pro組氨酸His精氨酸ArgU亮氨酸Leu脯氨酸Pro組氨酸His精氨酸ArgC亮氨酸Leu脯氨酸Pro谷氨酰胺Gln精氨酸ArgA亮氨酸Leu脯氨酸Pro谷氨酰胺Gln精氨酸ArgG

A異亮氨酸Ile蘇氨酸Thr天冬酰胺Asn絲氨酸SerU異亮氨酸Ile蘇氨酸Thr天冬酰胺Asn絲氨酸SerC異亮氨酸Ile蘇氨酸Thr賴氨酸Lys精氨酸ArgA甲硫氨酸Met蘇氨酸Thr賴氨酸Lys精氨酸ArgG

G纈氨酸Val丙氨酸Ala天冬氨酸Asp甘氨酸GlyU纈氨酸Val丙氨酸Ala天冬氨酸Asp甘氨酸GlyC纈氨酸Val丙氨酸Ala谷氨酸Glu甘氨酸GlyA纈氨酸Val丙氨酸Ala谷氨酸Glu甘氨酸GlyG

*

UGA在所有生物的線粒體中編碼色氨酸；CUA在酵母線粒體中編碼蘇氨酸；AGA在果蠅中編碼絲氨酸，在哺乳動物線粒體中編碼終止子；AUA在哺乳動物、果蠅和酵母線粒體中編碼蛋氨酸。2.1.3基因工程研究的基本技術(shù)路線

2.1基因工程概況

2.1.4基因工程突出的優(yōu)點

打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間的界限可以使原核生物與真核生物之間的遺傳信息進行相互重組和

轉(zhuǎn)移可以使動物與植物之間的遺傳信息進行相互重組和轉(zhuǎn)移可以使人與其他生物間的遺傳信息進行相互重組和轉(zhuǎn)移大大縮短了育種年限

2.1基因工程概況

2.2.1DNA

2.2.1.1DNA的組成和結(jié)構(gòu)

DNA由腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成。脫氧核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸基組成。四種脫氧核苷酸的脫氧核糖、磷酸基的結(jié)構(gòu)和位置相同，只是各自的堿基不同。

2.2

DNA重組

2.2.1.1DNA的組成和結(jié)構(gòu)組成：堿基有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4種。脫氧核苷酸之間通過磷酸二酯鍵連接。多個脫氧核苷酸按此方法連接成多聚脫氧核苷酸，其一端為游離的5′-磷酸基(5′-P)稱為5′端；另一端為游離的3′-羥基(3′-OH),稱為3’端。

2.2

DNA重組

2.2.1.1DNA的組成和結(jié)構(gòu)

DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

DNA兩條脫氧核苷酸鏈總是按照堿基A與T互補配對和G與C互補配對的，通過氫鍵形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為雙鏈DNA。少數(shù)病毒和噬菌體中的DNA是以單鏈形式存在的。2.2.1.1DNA的組成和結(jié)構(gòu)堿基的互補配對和書寫方式

2.2

DNA重組

2.2.1.2DNA的功能

（1）DNA分子能在細胞內(nèi)復(fù)制以原有的DNA鏈為模板，從特定的復(fù)制起始位點（ori）起始，復(fù)制出新的DNA鏈。

（2）DNA是基因的主要攜帶者

一個基因是DNA分子上的一個特定的核苷酸序列。2.2.1.2DNA的功能原核生物基因啟動子相關(guān)的保守核苷酸序列Pribnow框或-10區(qū)：-4~-13bp之間由６個核苷酸組成，多數(shù)是TATAAT序列。-35區(qū)：-35bp前后保守的TTGACA序列。動、植物基因啟動子相關(guān)的保守核苷酸序列生物類型

TATA區(qū)（-25~-30）

CAAT區(qū)（-70~-80）

GC區(qū)（-80~-100）動物TATAATAGGCCAACTGCCACACCC植物TCTATATA1~3CA或TGTATAAA1~3CACA2~5GNGA2~4CC或TA2~5TNGA2~4TTGGGCGGG2.2.1.2DNA的功能終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列2.2

DNA重組2.2.2獲得DNA片段的主要途徑目的：（1）獲得含有基因的DNA片段（2）獲得含有基因表達調(diào)控因子的DNA片段（3）獲得含有與基因重組有關(guān)的核苷酸序列的DNA片段主要途徑：

（1）限制性內(nèi)切核酸酶酶切法（2）PCR擴增法（3）化學(xué)合成法2.2.2獲得DNA片段的主要途徑2.2.2.1限制性內(nèi)切核酸酶和DNA片段化

限制性內(nèi)切核酸酶(restrictionendonuclease)

功能：能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列,并在合適的反應(yīng)條件下,使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開,產(chǎn)生具有3′-OH和5′-P的DNA片段。

命名：HindIII由HaemophilusinfluenzaeRd中屬名的H,種名的in和菌株代號的d組成,III表示從此菌株中提取的第三種限制性內(nèi)切核酸酶。

識別序列規(guī)律：旋轉(zhuǎn)對稱或左右互補對稱。

切割位點:在識別序列上使磷酸二酯鍵斷開的位置。

粘性末端：產(chǎn)生的DNA片段末端的一條鏈多出一至幾個核苷酸。3′端比5′端長的稱為3′粘性末端，5′端比3′端長的稱為5′粘性末端。平末端：產(chǎn)生的DNA片段末端是平齊的。限制性內(nèi)切核酸酶識別序列、酶切位點和酶切片段末端2.2.2.1限制性內(nèi)切核酸酶和DNA片段化

2.2.2.1限制性內(nèi)切核酸酶和DNA片段化

限制性內(nèi)切核酸酶的切割方法:單酶切法雙酶切法完全酶切法部分酶切方法2.2.2獲得DNA片段的主要途徑2.2.2.2

特異性DNA片段的PCR擴增特點：擴增特異DNA片段。一個待擴增的DNA片段，在3h內(nèi)可擴增出約106個這樣的DNA片段。關(guān)鍵因子：

※引物

※dNTP※模板DNA

※耐熱性DNA聚合酶2.2.2.2

特異性DNA片段的PCR擴增耐熱性DNA聚合酶普通耐熱DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶和TthDNA聚合酶等）高保真耐熱DNA聚合酶（如PfuDNA聚合酶和VentDNA聚合酶）長片段耐熱DNA聚合酶（如LongTaqDNA聚合酶）熱啟動耐熱DNA聚合酶（如HotstarTaqDNA聚合酶）測序用途的耐熱DNA聚合酶（如BcaBestDNA聚合酶和SacDNA聚合酶）等。2.2.2.2

特異性DNA片段的PCR擴增反應(yīng)過程：※反應(yīng)系統(tǒng)加熱至90~95℃,底物雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA；※降溫至37~60℃,使引物與模板DNA鏈互補序列雜交(復(fù)性

)；※升溫至70~75℃，耐熱性DNA聚合酶催化引物按5′→3′方向延伸,合成模板DNA鏈的互補鏈(延申)?！貜?fù)以上過程，一般經(jīng)過25～30次循環(huán)片段。2.2.2.2

特異性DNA片段的PCR擴增擴增示意圖2.2.2獲得DNA片段的主要途徑2.2.2.3化學(xué)合成目的基因

根據(jù)待合成的DNA片段預(yù)定的核苷酸序列，采用DNA合成儀，將4種核苷酸單體按3′→5′磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段。DNA合成儀合成引物合成寡核苷酸連桿合成基因片段2.2.3DNA片段的連接2.2.3.1DNA連接酶（DNAligase）催化機理：催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3′-OH末端與5′-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前常用的連接酶：

E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4RNA連接酶熱穩(wěn)定連接酶2.2.3DNA片段的連接具互補粘性末端片段之間的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接2.2.3DNA片段的連接具平末端DNA片段之間的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行連接2.2.3DNA片段的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接2.2.3DNA片段的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行連接2.2.3DNA片段的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接

DNA片段加連桿后或加銜接頭連接2.2.3DNA片段的連接

2.2.3.3DNA重組類型

插入重組置換重組2.3基因克隆載體基因克隆載體的含義

能夠承載外源基因，并將其帶入受體細胞得以相對穩(wěn)定維持的DNA分子稱為基因克隆載體（genecloningvector）。基因克隆載體應(yīng)具備的基本條件具有1個或多個克隆位點。進入受體細胞后，一般是能夠以不同的形式進行復(fù)制。含有供選擇克隆子的標記基因?？寺≥d體必須是安全的。2.3基因克隆載體克隆載體種類按構(gòu)建克隆載體的材料來源分:

質(zhì)?？寺≥d體、病毒（噬菌體）克隆載體、線粒體克隆載體、

人工染色體克隆載體、葉綠體克隆載體......按克隆載體的用途分:

一般克隆載體、表達載體、建庫載體、T或U載體......

按克隆載體的受體生物分:原核生物克隆載體：

大腸桿菌克隆載體、放線菌克隆載體......真核生物克隆載體酵母克隆載體、植物克隆載體、動物克隆載體、

人克隆載體......

2.3基因克隆載體2.3基因克隆載體含義：以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建的克隆載體，必須含有質(zhì)粒的復(fù)制起始位點。種類：

大腸桿菌質(zhì)粒載體藍藻穿梭質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體酵母2μm質(zhì)粒載體

......2.3.1質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)粒DNA2.3.1質(zhì)?？寺≥d體pBR322簡圖2.3.1質(zhì)?？寺≥d體2.3.1質(zhì)粒克隆載體2.3.1質(zhì)?？寺≥d體2.3.1質(zhì)?？寺≥d體2.3基因克隆載體含義

以病毒（噬菌體）DNA或cDNA為主構(gòu)建的克隆載體，或者通過轉(zhuǎn)染直接進入宿主細胞，或者包裝成病毒顆粒后通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進入宿主細胞。種類

噬菌體克隆載體：

λ噬菌體克隆載體

Cosmid載體

植物病毒克隆載體：CaMV克隆載體

動物病毒克隆載體：痘苗病毒載體腺病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體入噬菌體載體gtwes-λB

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體痘苗病毒載體示意圖2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體（1）含義：指能在宿主細胞中穩(wěn)定地復(fù)制并準確傳遞給子細胞的人工構(gòu)建的染色體。（2）特點：能容納長達1000kb以上的外源DNA片段。（3）用途：構(gòu)建基因組文庫,克隆和轉(zhuǎn)移完整的高分子量基因,基因功能鑒定,基因治療……

2.3基因克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體（4）類型：線形的人工染色體：必須含有端粒、著絲粒和復(fù)制起始區(qū)。包含：酵母人工染色體（YAC)人類人工染色體（HAC)哺乳動物人工染色體（MAC)環(huán)形的人工染色體：不需要端粒和著絲粒，

必須含有合適的復(fù)制起始區(qū)。包含：細菌人工染色體(BAC)

源于噬菌體Ｐ1的人工染色體(PAC)

雙元細菌人工染色體(BIBAC)

可轉(zhuǎn)化人工染色體(TAC)2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體2.3基因克隆載體

2.3.4體內(nèi)同源重組整合載體（系統(tǒng)）2.3.4.1常規(guī)基因整合平臺系統(tǒng)

內(nèi)源平臺雙交換置換載體內(nèi)源平臺雙交換插入載體內(nèi)源平臺單交換插入載體外源平臺雙交換插入載體2.3.4.1常規(guī)基因整合平臺系統(tǒng)

2.3.4體內(nèi)同源重組整合載體（系統(tǒng)）2.3.4.2基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統(tǒng)loxP位點序列示意圖2.3.4.2基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統(tǒng)2.4獲得目的基因2.4.1目的基因來源

目的基因：在基因工程設(shè)計和操作中，被用于基因重組、改變受體細胞性狀和獲得預(yù)期表達產(chǎn)物的基因。

目的基因的生物來源:真核生物染色體基因組原核生物染色體基因組質(zhì)粒基因組病毒（噬菌體）基因組

線粒體基因組葉綠體基因組

2.4獲得目的基因2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.1利用限制性內(nèi)切核酸酶酶切法直接分離

目的基因

2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.2利用PCR直接擴增目的基因PCR擴增含目的基因DNA示意2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.3目的基因的化學(xué)合成2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.4通過構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離的基因2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.4通過構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因2.5目的基因?qū)胧荏w細胞

2.5.1受體細胞

2.5.1.1原核生物

種類：大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌、棒狀桿菌、放線菌等2.5目的基因?qū)胧荏w細胞

2.5.1.1原核生物

特點：大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的進入;沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩;基因組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析；原核生物多數(shù)為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單,繁殖迅速，實驗周期短，重復(fù)實驗快。2.5.1受體細胞

2.5.1.2真核生物種類：

酵母：基因結(jié)構(gòu)相對比較簡單，便于基因工程操作；

培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉；基因表達產(chǎn)物能分泌到培養(yǎng)基中,便于產(chǎn)物的提取加工;

不含特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素，是安全的受體細胞。植物細胞：具全能性。

有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草和擬南芥等。動物細胞：多采用生殖細胞、受精卵細胞或胚細胞以及干細胞。

有豬、羊、牛、魚、鼠、猴等。2.5.1受體細胞2.5.1.2真核生物特點：真核生物細胞具備真核基因表達調(diào)控以及表達產(chǎn)物加工和分泌等的機制，因此作為受體細胞表達真核基因優(yōu)于原核生物細胞。

真核細胞模式圖2.5目的基因?qū)胧荏w細胞

2.5.2重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

電穿孔轉(zhuǎn)化法微彈轟擊(基因槍)轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法超聲波處理轉(zhuǎn)化法

脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

體內(nèi)注射轉(zhuǎn)化法花粉管通道轉(zhuǎn)化法

精子介導(dǎo)法低能離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法2.5.2.1外源DNA轉(zhuǎn)化方法2.5.2外源DNA導(dǎo)入受體細胞2.5.2.2病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法

用病毒(噬菌體)的DNA（或cDNA）構(gòu)建成重組DNA，在體外包裝成重組病毒(噬菌體)顆粒，通過感染使重組DNA進入受體細胞。

方式：重組病毒直接感染受體細胞重組病毒同另一輔助病毒一起感染受體細胞重組病毒感染互補型受體細胞系適用：主要用于基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和動植物的轉(zhuǎn)基因。2.5.2.2病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法2.5.2外源DNA導(dǎo)入受體細胞2.5.3克隆子的篩選2.5.3.1根據(jù)載體標記基因篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)載體抗菌素抗性基因篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)載體除草劑抗性基因篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)LacZ′基因互補顯色篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)生長調(diào)節(jié)劑非依賴型篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)核苷酸合成代謝相關(guān)酶基因缺失互補篩

選轉(zhuǎn)化子2.5.2外源DNA導(dǎo)入受體細胞2.5.3克隆子的篩選2.5.3.2根據(jù)報告基因篩選轉(zhuǎn)化子β-葡萄糖酸苷酶基因（gus）

螢火蟲熒光素酶基因（luc）綠色熒光蛋白基因（gfp）2.5.3.3根據(jù)形成噬菌斑篩選轉(zhuǎn)化子

2.6重組子的鑒定2.6.1根據(jù)重組DNA分子特征鑒定重組子

2.6.1.1根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子2.6.1.2根據(jù)重組DNA分子酶切圖譜鑒定重組子2.6.1.3根據(jù)PCR擴增片段鑒定重組子2.6.1.4采用DNA分子雜交法鑒定重組子Southern印跡雜交斑點印跡雜交菌落（或噬菌斑）