HYT 0319-2021 貝類(lèi) 脂溶性海洋生物毒素的檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（正式版）

中華人民共和國(guó)海洋行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)貝類(lèi)脂溶性海洋生物毒素的檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法Shellfish—Determination中華人民共和國(guó)自然資源部發(fā)布HY/T0319—2021 I 2規(guī)范性引用文件 3原理 4試劑和材料 5儀器設(shè)備 2 37試驗(yàn)步驟 38結(jié)果計(jì)算與表述 59精密度 6 6附錄A(資料性)脂溶性海洋生物毒素 7附錄B(資料性)特征離子質(zhì)量色譜圖 8附錄C(規(guī)范性)脂溶性海洋生物毒素的毒性因子 參考文獻(xiàn) I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由中華人民共和國(guó)自然資源部提出。本文件由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC283)歸口。本文件起草單位：國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、中國(guó)科學(xué)院海洋研究所、廈門(mén)大學(xué)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海研究所。1貝類(lèi)脂溶性海洋生物毒素的檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法警示——為避免毒素的危害，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。移液管及移液器吸頭等用過(guò)的器材、廢棄的提取液等應(yīng)在次氯酸鈉溶液(5%)浸泡1h以上以使毒素分解。酸毒素、環(huán)亞胺毒素等11個(gè)毒素化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法原理、操作步驟及結(jié)果計(jì)算等。本文件適用于貝類(lèi)體中脂溶性海洋生物毒素的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3原理貝類(lèi)樣品經(jīng)甲醇提取，堿性條件下水解釋放酯化態(tài)生物毒素部分，用HLB固相萃取柱凈化，液相4試劑和材料4.2甲醇(CH?OH):色譜純。4.5氨水(NH?·H?O):濃度≥25%。4.6氫氧化鈉(NaOH)。4.7鹽酸(HCL):濃度≥36%。4.8氫氧化鈉溶液(2.5mol/L):準(zhǔn)確稱(chēng)取50g氫氧化鈉，用水定容至500mL,室溫保存。4.9鹽酸溶液(2.5mol/L):準(zhǔn)確量取104.5mL鹽酸，用水定容至500mL,室溫保存。4.10甲醇溶液(30%):量取30mL甲醇加到70mL水中，混合均勻，室溫，現(xiàn)用現(xiàn)配。4.11甲醇溶液(20%):量取20mL甲醇加到80mL水中，混合均勻，室溫，現(xiàn)用現(xiàn)配。4.12氨水甲醇溶液(0.3%):吸取0.3mL氨水，用甲醇定容至100mL,室溫，現(xiàn)用現(xiàn)配。AZA2、AZA3、GYM、SPX1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度≥97%,避光保存于一20℃。24.14脂溶性海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別吸取適量的各脂溶性海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(見(jiàn)4.13),甲醇(見(jiàn)4.2)配制儲(chǔ)備溶液。0.22μm濾膜(見(jiàn)5.12)過(guò)濾，一20℃避光保存?zhèn)溆?。各脂溶性海洋生物毒素?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度分別為：OA40ng/mL,DTX140ng/mL,DTX240ng/mL,YTX400ng/mmoYTX400ng/mL,PTX21000ng/mL,SPX1200ng/mL,GYM10ng/mL,AZA1200ng/mL,AZA2100ng/mL,AZA3100ng/mL。4.15脂溶性海洋生物毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取適量的各脂溶海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(見(jiàn)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(OA、DTX1、DTX2、YTX、homoYTX)。0.22μm濾膜(見(jiàn)5.12)過(guò)濾，-20℃避光保存?zhèn)溆谩８髦苄院Ｑ笊锒舅氐臐舛纫?jiàn)表1。表1脂溶性海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液組別濃度15負(fù)離子5555儀器設(shè)備5.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源(ESI)。5.2分析天平：感量0.00001g。5.5渦漩振蕩器。5.6離心機(jī)。5.7水浴鍋。5.8固相萃取裝置。5.9真空泵。5.11固相萃取柱：基質(zhì)為含有N-乙烯吡咯烷酮聚合物的吸附劑，填料質(zhì)量為30mg,體積為1mL,或者相當(dāng)。36樣品用清水將貝類(lèi)外表清洗干凈。切開(kāi)閉殼肌打開(kāi)貝殼，用蒸餾水淋洗貝類(lèi)內(nèi)部以清除泥沙和其他雜物，取出貝肉置于孔徑約2mm的金屬篩網(wǎng)上瀝水5min。為保證樣品的均勻性，至少取100g貝肉用勻質(zhì)機(jī)勻漿30min,充分混勻。7試驗(yàn)步驟稱(chēng)取2.00g貝類(lèi)組織勻漿于具塞離心管中。加入9.0mL甲醇(見(jiàn)4.2),用渦旋振蕩器混勻1min,3000rpm離心10min,上清液轉(zhuǎn)移至20mL的容量瓶中，沉渣再加入9mL甲醇(見(jiàn)4.2)重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，用甲醇(見(jiàn)4.2)定容至20mL,將溶液分成兩份，備用。為了檢測(cè)酯化態(tài)的OA組毒素含量。取1.0mL(7.1中的一份)放入色譜進(jìn)樣瓶中，加入125μL氫氧化鈉溶液(見(jiàn)4.7),用渦旋振蕩器混勻0.5min,置于76℃水浴40min,冷卻至室溫，加入125μL鹽酸溶液(見(jiàn)4.8)中和，渦旋混勻0.5min,0.22μm濾膜過(guò)濾后備用。固相萃取柱依次用1.0mL甲醇活化、1.0mL30%甲醇平衡。取1.0mL提取液(7.1中的另一份)加2.8mL水混勻后轉(zhuǎn)入預(yù)處理的固相萃取柱，以約每秒一滴的流速通過(guò)固相萃取柱，用1.0mL20%甲醇溶液淋洗，再以1.0mL氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，搖勻后，0.22μm濾膜過(guò)濾，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。按照7.3步驟凈化水解液(見(jiàn)7.2)。7.4樣品測(cè)定7.4.1正離子模式液相色譜參考條件正離子模式測(cè)定PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1,液相色譜參考條件如下。b)流動(dòng)相：A:2mmol/L甲酸銨和50mmol/L甲酸的水溶液；B:2mmol/L甲酸銨和50mmol/L甲酸的95%乙腈水溶液。d)柱溫：25℃。f)流動(dòng)相梯度：0min～4min,10%B線性變化至80%B;4min～6min,保持80%B,6min~6.5min線性變化至10%B,平衡2.5min。7.4.2負(fù)離子模式液相色譜參考條件負(fù)離子模式測(cè)定OA、DTX1、DTX2和YTX、homoYTX,液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：C18,150mm×3.0mm,填料粒徑3.5μm,或相當(dāng)者。b)流動(dòng)相：A:0.05%的氨水溶液(pH11);B:含有0.05%氨水的乙腈-水(90/10,體積比)溶液4f)流動(dòng)相梯度：1min～10min,10%B線性變化至90%B;10min～13min,保持90%B,13min~15min線性變化至10%B,平衡4min。7.4.3質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件如下：a)離子源：電噴霧離子源。b)掃描模式：正離子和負(fù)離子模式。c)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。d)噴霧電壓：4500V。e)毛細(xì)管溫度：450℃(正離子模式);600℃(負(fù)離子模式)。f)源內(nèi)碰撞解離電壓：5V。g)霧化氣流速：60L/min。h)輔助加熱氣流速：50L/min。i)離子碎片參數(shù)見(jiàn)表2。表2離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞電壓目標(biāo)毒素子離子m/zVV5HY/T0319—2021合表3要求。各毒素的特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)附錄B。表3定性測(cè)定相對(duì)離子豐度的最大允許偏差允許的相對(duì)偏差 (1)c;從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中得到的試樣中脂溶性海洋生物毒素溶液濃度，單位為納克每毫升c。——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中得到的空白試驗(yàn)中脂溶性海洋生物毒素溶液濃度，單位為納克每毫升脂溶性海洋生物毒素的毒性因子列于附錄C。樣品中脂溶性海洋生物毒素的含量則按照毒性因69精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%。本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%,實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤37%。本方法各毒素的定量限示于表4中。本方法在0.08μg/kg～200μg/kg添加濃度水平上的回收率為80%～120%。表4脂溶性海洋生物毒素定量限目標(biāo)毒素定量限7脂溶性海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)及相關(guān)信息見(jiàn)表A中文名稱(chēng)鰭藻毒素-1原多甲藻酸-1原多甲藻酸-2原多甲藻酸-313-去甲螺旋內(nèi)酯C8(資料性)特征離子質(zhì)量色譜圖負(fù)離子和正離子模式下脂溶性海洋生物毒素特征離子色譜圖如圖B.1和圖B.2所示。圖B.1負(fù)離子模式下脂溶性海洋生物毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液特征離子質(zhì)量色譜圖9離子強(qiáng)度/eps離子強(qiáng)度/eps離子強(qiáng)度/cps圖B.2正離子模式下脂溶性海洋生物毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液特征離子質(zhì)量色譜圖目標(biāo)毒素毒性因子(r)1pgOA當(dāng)量/kg11pgPTX當(dāng)量/kg1pgAZA當(dāng)量/kg11[1]GB5009.212食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)貝類(lèi)中腹瀉性貝類(lèi)毒素的測(cè)定[2]海洋生物毒素歐盟參考實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)