貝類毒素的測定

關于貝類毒素的測定一、麻痹性貝類毒素（PSP）

Para1yticalshellfishpoisoning

PSP中毒是最常見的食用貝類中毒PSP由一組石房蛤毒及其衍生物組成，PSP與渦鞭毛藻的水華有關（＞106個細胞／升）PSP在世界范圍內(nèi)分布PSP中毒引起神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，呼吸困難，感覺窒息，心肺衰竭而在2—24小時內(nèi)死亡一般PSP中毒在0.5-2h的時間內(nèi)，癥狀逐漸發(fā)展，能承受12h以上的中毒者一般能康復

第2頁,共31頁，星期六，2024年，5月麻痹性貝類毒素的測定方法國際上麻痹性貝類毒素的檢測方法較多，主要有小白鼠法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、放射性免疫法等。生物法(即小白鼠法)是國際慣用的麻痹性貝類毒素的測定方法，已被美國公職分析化學家協(xié)會《公定分析方法》（AOAO）收入，而成為最普遍應用的檢驗方法。生物法(即小白鼠法)，系采用ICR系列的小白鼠作為檢驗動物，進行貝類毒素分析生物法(即小白鼠法)優(yōu)勢：當使用生物法檢測法時，一旦發(fā)現(xiàn)超標樣品，則本批樣品不得食用，這說明所檢測貝類中相關的毒素含量已經(jīng)影響到人們的食用安全，不適合食用。第3頁,共31頁，星期六，2024年，5月麻痹性貝類毒素的測定生物法

(SC/T3023-2003)

原理根據(jù)小鼠注射貝類提取液后的死亡時間，查出鼠單位，計算確定每100g貝肉中PSP的含量特點：測定結果代表存在于貝肉內(nèi)各種化學結構的麻痹性貝類毒素的總量鼠單位mouseunit，MU：對體重為20g的小白鼠腹腔注射1mL麻痹性貝類毒素后，小鼠在15min時死亡所需的最低毒素量

第4頁,共31頁，星期六，2024年，5月試劑鹽酸溶液：0.1mol/L鹽酸溶液：5mol/L氫氧化鈉溶液：0.1mol/L第5頁,共31頁，星期六，2024年，5月儀器和設備均質(zhì)器天平（感量0.1g）離心機pH計秒表玻璃皿；燒杯、量筒、容量瓶、攪拌棒等注射器：1mL注射器針頭：8#第6頁,共31頁，星期六，2024年，5月小白鼠：體重為19-21g的健康ICR系雄性小白鼠若體重＜19g或＞21g，查表中的校正系數(shù)便可得到校正的死亡時間體重＞23g、或已用過的小白鼠則不能使用

第7頁,共31頁，星期六，2024年，5月樣品的測定檢樣的制備貝類洗凈外殼，切斷閉殼肌，開殼，用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來雜質(zhì)，仔細取貝肉，收集瀝水5min（避免貝肉堆積），撿出碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì)注意：取肉時切勿割破肉體，開殼前不能加熱或用麻醉劑第8頁,共31頁，星期六，2024年，5月樣品的測定檢樣的制備貝類罐頭1.將罐內(nèi)所有內(nèi)容物（包括貝肉組織及汁液），于均質(zhì)器中均質(zhì)2.大容量的罐頭，則過濾分離貝肉及汁液，分別稱重，將固形物和湯汁按比例混合，充分均質(zhì)冷凍貝類在室溫下，使冷凍的樣品（帶殼或脫殼的）呈半冷凍狀態(tài)，按上述規(guī)定的方法清洗、開殼、淋洗、取肉、均質(zhì)第9頁,共31頁，星期六，2024年，5月樣品的測定提取取100g樣品于800mL燒杯中，加0.1mol/LHCl溶液100mL充分攪拌，檢查pH（pH應為2.0-4.0）。需要時，可逐滴加入5mol/LHCl溶液或0.1mol/LNaOH溶液調(diào)整pH，加堿時速度要慢，同時需不斷攪拌，防止局部堿化破壞毒素將混合物加熱，并徐徐煮沸5min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至2.0-4.0（切勿＞4.5）。將混合物移至量筒中并稀釋至200mL第10頁,共31頁，星期六，2024年，5月樣品的測定提取將混合物倒回燒杯，攪拌至均質(zhì)狀，使其沉降至上清液呈半透明狀，不能堵塞注射針頭即可必要時將混合物或上清液以3000r/min離心5min，或用濾紙過濾保留進行小鼠注射用的足量液體（約10mL）第11頁,共31頁，星期六，2024年，5月樣品的測定小鼠試驗選擇ICR系小鼠稱重：以感量為0.1g的天平將小鼠稱重并記錄重量第12頁,共31頁，星期六，2024年，5月樣品的測定小鼠試驗每個樣品注射3只小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL提取液。注射時若有一滴以上提取液溢出，須將該只小鼠丟棄，并重新注射一只小鼠記錄注射完畢時間，仔細觀察并用秒表記錄小鼠停止呼吸時的死亡時間（到小鼠呼出最后一口氣止）第13頁,共31頁，星期六，2024年，5月樣品的測定小鼠試驗若注射樣品原液后，1只或2只小鼠的死亡時間大于7min，則需再注射至少3只小鼠以確定樣品的毒力若小鼠的死亡時間小于5min，則要稀釋樣品提取液后，再注射另一組小鼠（3只），得到5min-7min的死亡時間稀釋提取液時，要調(diào)節(jié)pH至2.0-4.0,逐滴加入0.1mol/L或0.01mol/LHCl溶液第14頁,共31頁，星期六，2024年，5月結果的計算與判斷毒力的計算根據(jù)小鼠的死亡時間，在附錄B中查出相應的每毫升注射液的鼠單位數(shù)M

將存活鼠的死亡時間視為大于60min即相當于＜0.875MU若試驗動物重量＜19g或＞21g。則根據(jù)附錄C查出重量校正系數(shù)k樣品中PSP的含量按公式（1）計算?！?）式中：

X—樣品中PSP含量，每百克樣品中鼠單位（MU/100g）

Ki—每只小鼠的重量校正系數(shù)

Mi—每只小鼠的鼠單位數(shù)，鼠單位（MU）

D—樣品提取液的稀釋倍數(shù)

200—樣品量，克（g）第15頁,共31頁，星期六，2024年，5月第16頁,共31頁，星期六，2024年，5月第17頁,共31頁，星期六，2024年，5月結果的計算與判斷毒力單位轉換樣品中的毒力單位的按公式（4）計算。F·80μg/100g＝400MU/100g………（3）

F=5式中：

F—毒素轉換系數(shù)；

80μg/100g—樣品中PSP限量，μg/100g400MU/100g—樣品中PSP限量，MU/100g

第18頁,共31頁，星期六，2024年，5月二、腹瀉性貝類毒素（DSP）DiarrheticshellfishpoisoningDSP是由于雙殼貝類濾食含毒的渦鞭毛藻而引起影響較嚴重的地區(qū)主要是日本和歐洲沿海國家，發(fā)病率高，引起許多國家地區(qū)的關注受DSP中毒的癥狀表現(xiàn)為消化功能紊亂（腹瀉、嘔吐、腹痛），食用含毒貝類后30分鐘至幾小時出現(xiàn)癥狀，中毒者一般在3-4天康復，尚無死亡病例第19頁,共31頁，星期六，2024年，5月腹瀉性貝類毒素的測定方法在國際上對腹瀉性貝類毒素的檢測方法較多，主要有生物法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、放射性免疫法等生物法（小白鼠法，Mousebioassay）是最常用的一種方法第20頁,共31頁，星期六，2024年，5月

腹瀉性貝類毒素的測定生物法

(SC/T3024-2004)原理用丙酮提取貝類中毒素，再轉移至乙醚中，經(jīng)減壓濃縮蒸干后，再以1%吐溫－60生理鹽水溶解殘留物，注射小白鼠觀察存活情況，計算其毒力試劑和材料丙酮（分析純）乙醚（分析純）1%吐溫-60生理鹽水：稱取1.0g吐溫-60，溶于生理鹽水（0.8%NaCl）中，并定容至100.0mL第21頁,共31頁，星期六，2024年，5月儀器和設備旋轉蒸發(fā)器均質(zhì)器磨口燒瓶：圓底，500mL，250mL，100mL布氏漏斗：φ100mm分液漏斗：具塞，500mL天平：感量0.1g刻度試管：10mL，具塞冰箱：0℃-5℃和-15℃--20℃注射器：1mL注射器針頭：8#小白鼠：體重為16-20g的健康ICR系雄性小白鼠

第22頁,共31頁，星期六，2024年，5月檢樣的制備生鮮帶殼的貝類用清水徹底洗凈貝類外殼，開殼，用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來雜質(zhì)，仔細取出貝肉，切勿割破肉體收集貝肉，瀝水5min，撿出碎殼等雜物，迅速冷凍，貯藏備用注意不要破壞閉殼肌以外的組織，尤其是中腸腺（又稱消化盲囊，組織呈暗綠色或褐綠色）。開殼前不能加熱或用麻醉劑冷凍貝類在室溫下，使冷凍的樣品（帶殼或去殼的）呈半冷凍狀態(tài)，按上述方法清洗、開殼、淋洗、取肉第23頁,共31頁，星期六，2024年，5月檢樣的制備取樣可以切取中腸腺的貝類（扇貝、貽貝、牡蠣等），稱取200g貝肉后，仔細切取全部中腸腺，將中腸腺稱重后細切混合做為檢樣，注意不要使中腸內(nèi)容物污染案板對于尚未確定部位毒性的貝類及不易切取中腸腺的小型貝肉，可將全部貝肉細切、混合，做為檢樣為避免毒素的危害，應戴手套進行檢驗操作，移液管等用過的器材應在5%的次氯酸鈉溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解；廢棄的提取液等也應用5%的次氯酸鈉溶液處理第24頁,共31頁，星期六，2024年，5月提取取處理好的中腸腺，或200g貝肉置于均質(zhì)杯內(nèi)，均質(zhì)2min加3倍量丙酮，與樣品充分攪拌均勻后，用布氏漏斗抽濾并收集提取液。對殘渣以檢樣兩倍量丙酮再次抽濾兩次，合并抽濾液第25頁,共31頁，星期六，2024年，5月提取將抽提液移入500mL的磨口燒瓶中，減壓濃縮（旋轉蒸發(fā)器，56℃）去除丙酮，直至在液體表面分離出油狀物將濃縮液移入分液漏斗內(nèi)，以100mL－200mL乙醚和少量的水洗下粘壁部分，輕輕振蕩(不能生成乳濁液)，靜置分層后，去除水層(下層)用相當乙醚半量的蒸餾水洗乙醚層兩次，再將乙醚層移入250mL的磨口燒瓶中，減壓濃縮(旋轉蒸發(fā)器，35℃)去除乙醚第26頁,共31頁，星期六，2024年，5月提取以少量乙醚將濃縮物移入100mL磨口燒瓶中，再次減壓濃縮去除乙醚以1%吐溫60生理鹽水將全部濃縮物在刻度試管中稀釋到10mL。此時1mL試液相當于20g去殼貝肉的重量，以此懸浮液做為試驗原液第27頁,共31頁，星期六，2024年，5月小白鼠試驗振蕩使試液或其稀釋液成為均勻的懸浮液將每只小白鼠稱重，每三只小白鼠為一組，分別將1mL試液注射到小白鼠腹腔中同時，另取三只小白鼠作為對照組，注射1mL1%吐溫-60生理鹽水于腹腔中觀察自注射開始到24h后的小白鼠存活情況，求出一組三只中死亡兩只及兩只以上的最小注射量小白鼠注射腹瀉性貝毒后的癥狀為運動不活潑，大多呼吸異常，致死時間長第28頁,共31頁，星期六，2024年，5月結果計算和表述毒力的計算使體重16-20g的小白鼠在24h死亡的毒力為1個小白鼠單位（MU）樣品中DSP毒力的計算，按表1選擇24h內(nèi)死亡二只及二只以上白鼠的最小注射量及最大稀釋倍數(shù)進行計算第29頁,共31頁，星期六，2024年，5月注射量與毒力的關系

試驗液注射量mL檢樣量1）g毒力MU/g原液原液2倍稀釋液