DNA的生物合成課件

DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)

1.DNA復制（DNA→DNA）2.逆轉(zhuǎn)錄(RNA→DNA)復制(replication)以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。親代DNA復制子代DNADNA復制的基本特征BasicRulesofDNAReplication

第一節(jié)半保留復制semi-conservativereplication半不連續(xù)復制semi-discontinuousreplication雙向復制bidirectionalreplication復制的基本特征

DNA復制時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全重新合成，兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致，這種復制方式稱為半保留復制(semi-conservativereplication)。半保留復制的概念一、DNA以半保留方式進行復制含15N-DNA的細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液(14N)

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液第二代

——實驗結(jié)果支持半保留復制的設想。15N-DNA14N-DNA實驗證據(jù)（同位素標記技術(shù)、密度梯度離心）1958年MatthewMesselson和FranklinStahl遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。半保留復制的意義按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性

。

原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。二、DNA復制從起點向兩個方向延伸真核生物的多復制子復制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’3’復制子已完成復制的復制子復制進程復制起始點、復制子與復制叉3

5

3

5

3′5′3′5′解鏈方向領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)3′5′三、DNA復制反應呈半不連續(xù)特征子鏈沿母鏈模板復制，只能從5’向3’延伸。同一個復制叉上只能有一個解鏈方向。半不延續(xù)復制順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈（leadingstrand）。另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱為隨從鏈（laggingstrand）。復制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的半不連續(xù)性(semi-discontinuousReplication)。

DNA復制的酶學和拓樸學變化TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication第二節(jié)參與DNA復制的物質(zhì)參與DNA復制的物質(zhì)底物dNTP聚合酶DNA-pol模板解成單鏈的DNA母鏈引物與模板互補的RNA片段其它酶和蛋白質(zhì)因子底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶簡寫為DNA-pol模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合解螺旋酶引物酶單鏈DNA結(jié)合蛋白DNA連接酶等復制的基本化學反應特點：需要引物和模板；新鏈的延長5→3

方向PPiHOPPPG5′端3′端CGA聚合反應機理一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸之間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶

(DNA-dependentDNApolymerase)(DNA-directedDNApolymerase)縮寫：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性DNA聚合酶接切1959年獲諾貝爾生理學或醫(yī)學獎

奧喬亞科恩伯格

SeveroOchoaArthurKornberg（一）原核生物有3種DNA聚合酶２個核心酶1個

-復合物（

、

、

、

、

、

6種亞基）1對

-亞基（可滑動的DNA夾子）DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)包括：

亞基（130000）主要功能是合成DNA

亞基具有3

5

外切酶活性（復制保真性所必需）

亞基可增強其活性

亞基可能起組裝作用核心酶由

、

和

亞基組成：兩側(cè)的β亞基發(fā)揮夾穩(wěn)DNA模板鏈，并使酶沿模板滑動的作用2個

-亞基分別和1個核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復制叉1個全酶分子的2個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責合成前導鏈和后隨鏈。功能：有促進全酶組裝至模板上及增強核心酶活性的作用

-復合物由6種亞基組成：

、

、

、

、

、

小片段大片段/Klenow片段

N端C端木瓜蛋白酶Klenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。

聚合酶NC小片段大片段（Klenow片段）3'—5'外切酶5'—3'外切酶DNA-polⅠ（109kD）DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。DNA-polⅡ?qū)δ０宓奶禺愋圆桓?，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認為，它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。真核生物和原核生物DNA聚合酶的比較E.Coli真核細胞

功能Ⅰ填補復制中的DNA空隙，DNA修復和重組Ⅱ復制中的校對，DNA修復

DNA修復

線粒體DNA合成Ⅲ

錯配修復

引物酶

前導鏈和后隨鏈合成，錯配修復2.酶在復制延長時對堿基的選擇功能1.遵守嚴格的堿基配對規(guī)律3.復制出錯時酶的及時校讀功能DNA復制的保真性至少要依賴三種機制

二、DNA聚合酶的堿基選擇和

校對功能實現(xiàn)復制的保真性三、復制中的解鏈伴有DNA分子拓撲學變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈后，它才能起模板作用。理順DNA鏈拓撲異構(gòu)酶(gyrA,B)穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)運送和協(xié)同DnaBDnaC(dnaC)解開DNA雙鏈解螺旋酶DnaB(dnaB)辨認起始點DnaA(dnaA)蛋白質(zhì)（基因）通用名功能原核生物復制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)——利用ATP供能，在復制叉前解開一小段DNA1.解螺旋酶(helicase)：解螺旋酶(DnaB)3

5

3

5

引物3'HO5'引物酶該酶以DNA為模板，以核苷三磷酸（NTP）為底物催化合成RNA引物，為DNA的合成提供游離的3’-OH末端。2.引物酶(primerase)3

5

3

5

3.單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)

單鏈DNA結(jié)合蛋白對單鏈DNA有高親和力，能特異地結(jié)合到分開的單鏈DNA上。在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整解鏈過程中，在解開的兩條單鏈DNA分子的前方會出現(xiàn)過度擰緊、打結(jié)、纏繞和連環(huán)等現(xiàn)象。正超螺旋負超螺旋（二）DNA拓撲異構(gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)拓撲異構(gòu)酶的作用：切接作用水解連接切開一股DNA鏈封閉切口不需ATP切開雙股DNA鏈封閉切口需ATP拓撲異構(gòu)酶ⅠⅡ?qū)β菪淖饔盟沙诳朔そY(jié)

斷端沿螺旋軸松解的方向移動斷端沿螺旋軸松解的方向移動有ATP進入負超螺旋作用機制解螺旋酶和拓撲異構(gòu)酶的聯(lián)合作用：DNA雙鏈解成單鏈。

催化二段DNA鏈之間3’,5’磷酸二酯鍵的形成3’OH5’5’3’

OO-POO-有缺口的DNA鏈DNA連接酶ATPAMP+PPi

OO

POO-5’3’缺口封閉四.DNA連接酶連接復制中產(chǎn)生的單鏈缺口DNA連接酶原核生物DNA復制過程TheProcessofDNAReplicationinProkaryotes第三節(jié)需要解決兩個問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、復制的起始

E.coli復制起始點oriC--特殊的序列約245bp

GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···

11317293244

···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串聯(lián)重復序列反向重復序列5

3

5

3

（一）DNA解鏈解鏈過程

DnaB、DnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

（二）引物合成和引發(fā)體形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。解螺旋酶3

5

3

5

引物3'HO5'引物酶引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。在領(lǐng)頭鏈（模板）上，引物酶（DnaG）與解螺旋酶（DnaB）結(jié)合成復合物——解鏈及引物合成引物酶引物的生成

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polIII復制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

二、DNA鏈的延長復制的延長復制過程簡圖5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATP

AMP+PPi5

5

DNA連接酶隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接3

三、復制的終止岡崎片段的連接哺乳動物的細胞周期DNA合成期G1G2SM第四節(jié)真核生物DNA生物合成過程TheProcessofDNABiosynthesisineukaryotes

?真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同步啟動。一、真核生物復制的起始與原核生物基本相似?復制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和DNA-polδ（解螺旋酶活性）參與。?還需拓撲異構(gòu)酶和復制因子(RF)。二、真核生物復制的延長發(fā)生DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換前導鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際發(fā)生DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換的原因是Pol

不具備持續(xù)合成能力。DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白是RFC。DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換3'領(lǐng)頭鏈隨從鏈引物核小體三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體親代DNA真核生物DNA復制與核小體組裝同步進行，復制完成后隨即組裝成染色體真核生物DNA復制完成后，子鏈末端留下空隙，母鏈成單鏈四、端粒酶參與解決染色體末端復制問題1、端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?維持DNA復制的完整性結(jié)構(gòu)特點?由富含TG的重復序列組成;?人的端粒重復序列為5’-(TnGn)x-3’。TTTTGGGGTTTTGGGG…2、端粒酶(telomerase)

?特點：

1.

由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的復合物

2.

為特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身的RNA為

模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA

?功能：合成端粒DNA，維持端粒的長度端粒酶端粒酶的RNA端粒DNA末端1、端粒酶靠AnCn與母鏈DNA端粒結(jié)合內(nèi)在模板RNA2、以端粒酶RNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄，延長DNA母鏈3、端粒酶移位、空出RNA模板，再次延長母鏈，同時DNA母鏈反摺利于下游復制延伸。端粒酶的RNA4、延伸足夠長度后端粒酶脫離母鏈，代之以DNA-Pol。此時母鏈3′-OH反折，同時作為引物和模板，完成末端雙鏈復制。端粒酶的RNADNA-Pol端粒酶的催化延長作用

——爬行模型逆轉(zhuǎn)錄和其他復制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWay