工業(yè)菌種的分離和純培養(yǎng)技術(shù)（微生物育種技術(shù)課件）

工業(yè)菌種分離和純培養(yǎng)技術(shù)項目二工業(yè)微生物菌種的培養(yǎng)方法①從少量培養(yǎng)→大規(guī)模培養(yǎng)②從淺層培養(yǎng)→厚層（固體制曲）或深層（液體攪拌）培養(yǎng)③從固體培養(yǎng)→液體培養(yǎng)④從靜止式液體培養(yǎng)→通氣攪拌式的液體培養(yǎng)⑤從單批培養(yǎng)→連續(xù)培養(yǎng)→多級連續(xù)培養(yǎng)⑥從分散的微生物細(xì)胞→固定化的細(xì)胞集團(tuán)⑦從微生物細(xì)胞→動、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)；⑧從野生型菌種→突變株、遺傳工程菌株；⑨從單菌發(fā)酵→多菌發(fā)酵；⑩從低密度培養(yǎng)→高密度培養(yǎng)；?從人工控制的發(fā)酵罐→到多傳感器、計算機在線控制的自動化發(fā)酵罐等。微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展特點：

任務(wù)一、實驗室培養(yǎng)法（一）固體培養(yǎng)法（二）液體培養(yǎng)法好氧菌的固體培養(yǎng)厭氧菌的固體培養(yǎng)好氧菌的液體培養(yǎng)厭氧菌的液體培養(yǎng)（一）實驗室固體培養(yǎng)法1.好氧菌的固體培養(yǎng)試管斜面、培養(yǎng)皿平板、茄子瓶2.厭氧菌的固體培養(yǎng)實驗室中培養(yǎng)厭氧菌特殊的培養(yǎng)裝置或器皿配制特殊的培養(yǎng)基六種營養(yǎng)要素加入還原劑和氧化還原勢的指示劑①高層瓊脂柱：培養(yǎng)基中加入還原劑，裝入試管中滅菌后，只有表層有一些溶解氧，越是深層，其氧化還原電位勢越低，有利于厭氧菌的生長。如韋榮氏管（Veillontube）：長25cm，內(nèi)徑1cm，兩端可用橡皮塞封閉的玻璃管。②厭氧培養(yǎng)皿：

Brewer皿：利用凹形皿蓋制造狹窄空間，加上還原性培養(yǎng)基達(dá)到厭氧環(huán)境。

Spray或Bray皿：利用焦性沒食子酸+NaOH反應(yīng)造成無氧環(huán)境。③厭氧罐：

常規(guī)的不很嚴(yán)格的厭氧技術(shù)；對厭氧罐反復(fù)抽真空、灌氮氣，剩余氧在鈀催化劑的催化下，與灌入混合氣體中的氫氣還原成水而除去，從而形成良好的無氧環(huán)境。

④

Hungate滾管技術(shù)：嚴(yán)格厭氧技術(shù)利用除氧銅柱在350℃下與氧反應(yīng)來制備高純度氮，再用此高純度氮去驅(qū)除培養(yǎng)基配制、分裝過程中各種容器和小環(huán)境中的空氣，使培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌和貯存，以及接種、稀釋、培養(yǎng)、觀察、分離、移種和保藏等操作的全過程始終處于高度無氧的環(huán)境。從而保證了嚴(yán)格厭氧菌的存活。⑤厭氧手套箱：嚴(yán)格厭氧條件箱內(nèi)始終充滿成分為N2：CO2：H2＝85：5：10（V/V）的氣體，并有鈀催化劑保證箱內(nèi)處于高度無氧狀態(tài)。通過塑料手套進(jìn)行操作，外界物體進(jìn)出通過交換室。

（二）實驗室液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)法：好氧菌：確保培養(yǎng)液中含有較高的溶解氧濃度是關(guān)鍵。試管液體培養(yǎng)；三角瓶淺層液體培養(yǎng)：僅適用于兼性厭氧菌搖瓶培養(yǎng)：又稱振蕩培養(yǎng)；臺式發(fā)酵罐：幾升至幾十升，使用方便厭氧菌：放入?yún)捬豕藁騾捬跏痔紫渲?；培養(yǎng)基中加入巰基乙酸、半胱氨酸等有機還原劑。

一般情況下（1.013×105Pa，20℃），氧在水中的溶解度僅為6.2mL／L（0.28mmol／L），這些氧只能保證氧化8.3mg（即0.046mmol／L）葡萄糖，僅相當(dāng)培養(yǎng)基中常用葡萄糖濃度的1‰。

氧的供應(yīng)是好氧菌生長、繁殖中的限制因子。提高溶氧速率的具體措施：①淺層液體靜止培養(yǎng)；②利用往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床作搖瓶培養(yǎng)；③在發(fā)酵罐的底部通入加壓空氣，并用氣體分布器使其產(chǎn)生均勻、密集的微小氣泡；④對培養(yǎng)液進(jìn)行機械攪拌，并在發(fā)酵罐的壁上設(shè)置阻擋裝置等。厭氧罐或厭氧手套箱液體培養(yǎng)厭氧菌不必提供額外的培養(yǎng)措施單獨放在有氧環(huán)境下培養(yǎng)有機還原劑加入能顯著降低氧化還原電位的鐵絲等巰基乙酸、半胱氨酸、維生素C或皰肉等加入無機還原劑用深層培養(yǎng)或同時在液面上封一層石蠟油或凡士林-石蠟油臺式發(fā)酵罐實驗室培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法好氧菌的固體培養(yǎng)好氧菌的液體培養(yǎng)厭氧菌的固體培養(yǎng)厭氧菌的液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)法試管斜面培養(yǎng)皿瓊脂平板克氏扁瓶茄子瓶高層瓊脂柱厭氧培養(yǎng)皿厭氧罐亨蓋特滾管技術(shù)厭氧手套箱試管液體培養(yǎng)三角瓶淺層液體培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)臺式發(fā)酵罐嚴(yán)格厭氧任務(wù)二、微生物工業(yè)培養(yǎng)法（一）工業(yè)固態(tài)培養(yǎng)法：好氧菌：曲法培養(yǎng)。依制曲容器的形狀和規(guī)模分為：瓶曲、袋曲、盤曲、簾子曲、轉(zhuǎn)鼓曲、通風(fēng)曲等?！u油釀造厭氧菌：堆積培養(yǎng)法?！拙粕a(chǎn)曲根據(jù)制曲的容器形狀和規(guī)模的大小分類瓶曲袋曲（用塑料袋制曲）盤曲（用木盤制曲）簾子曲（用竹簾子制曲）轉(zhuǎn)鼓曲（用大型木質(zhì)空心轉(zhuǎn)鼓橫向轉(zhuǎn)動制曲）通風(fēng)曲（厚層制曲）機械化程度和生產(chǎn)效率較高的現(xiàn)代化制曲技術(shù)，醬油釀造業(yè)廣泛使用。食用菌制種和培養(yǎng)小曲紅曲掛曲（二）工業(yè)液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法：好氧菌：

淺盤培養(yǎng)：早期青霉素與檸檬酸發(fā)酵；

深層液體通氣培養(yǎng)：大型發(fā)酵罐+攪拌。

——糖化酶生產(chǎn)厭氧菌：

液體靜止培養(yǎng)法：液體培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，不通氣，不攪拌，靜置保溫培養(yǎng)，簡化了工藝，節(jié)約了能源。

——啤酒生產(chǎn)大型發(fā)酵罐案例：

——細(xì)菌接種技術(shù)按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%瓊脂含量一般為0.2%-0.7%不加任何凝固劑半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基常用來進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏

觀察微生物的運動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定

用于增菌，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實驗室進(jìn)行微生物的研究一、培養(yǎng)基的分類：固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物。比如肉湯培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基利用細(xì)菌代謝產(chǎn)物不同而使指示劑顯色反應(yīng)不同的原理，鑒別和鑒定細(xì)菌。如麥糠凱瓊脂培養(yǎng)基。營養(yǎng)培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長。用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。如SS瓊脂培養(yǎng)基。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。如血瓊脂培養(yǎng)基。特殊培養(yǎng)基如厭氧培養(yǎng)基。用于厭氧菌的培養(yǎng)。二、接種方法1.斜面接種法用于鑒定和保存菌種。2.液體培養(yǎng)基接種法可觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象或用作生化反應(yīng)實驗3.半固體培養(yǎng)基接種法穿刺接種法，用于保存菌種或觀察細(xì)菌動力二、接種方法

4.平板劃線接種法目的：使混合的細(xì)菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。方法：分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本。連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本。二、接種方法5.涂布接種法：用于測定標(biāo)本中活菌數(shù)和藥敏實驗細(xì)菌接種6.傾注培養(yǎng)法：用于活細(xì)菌計數(shù)。將上述已接種細(xì)菌的培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h，觀察細(xì)菌的生長現(xiàn)象。三、具體接種方法接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。圖－6斜面接種法-1①左手平托兩支試管，拇指壓住兩支試管。外側(cè)是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接種的空白斜面(兩支試管的斜面同時向上)

。右手將棉塞旋松，以便在接種時容易拔出。②右手拿接種環(huán)，在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌。③將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。12④將已灼燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)。先冷卻，而后再用環(huán)挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出并迅速伸入待接種試管底部，在斜面上由底部向上劃線。抽出接種環(huán)，塞上棉塞將試管插在試管架上，最后再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢。45678斜面接種法-1斜面接種（1）用左手大姆指、食指和無名指夾住菌種試管和待接種和斜面試管，右手?jǐn)Q松棉塞、不取下。（2）右手拿接種環(huán)，在火焰上燒灼滅菌，特別是箍處。斜面接種法-2（3）火焰邊取下兩個棉塞，不能放下；燒灼管口一周。（4）將接種環(huán)伸入試管內(nèi)，冷卻后，輕輕挑取少量菌體，立即將接種環(huán)抽出。（6）抽出接種環(huán)后，燒管口，塞棉塞，接種環(huán)滅菌。（5）火焰旁將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸到斜面培養(yǎng)基的底部，由里向外畫蛇形細(xì)線，線要畫得細(xì)些。液體接種和穿刺接種液體接種法(從斜面菌種接入培養(yǎng)液)：用接種環(huán)挑取斜面菌種送入培養(yǎng)液中，使環(huán)在液體表面與管壁接觸輕輕研磨，將環(huán)上的菌種全部洗入培養(yǎng)液中，取出接種環(huán)塞上棉塞。將試管輕輕撞擊手掌使菌體在培養(yǎng)液中均勻分布。最后將接種環(huán)燒紅滅菌。穿刺接種法(從斜面菌種接入(半)固體培養(yǎng)基)：用接種針經(jīng)火焰滅菌后，挑取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部，然后穿刺線緩慢將針抽出，塞上棉塞。燒紅接種針滅菌，則接種完畢。四、細(xì)菌的生長現(xiàn)象（一）在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象

渾濁生長、菌膜生長、沉淀生長（二）在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象長出菌落

菌苔生長（三）在半固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象沿穿刺線生長沿穿刺線擴散生長1、細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌落定義：指單個細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性。菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。菌落與菌苔菌落菌苔EMB瓊脂平板上大腸菌菌落具有金屬光澤SS瓊脂平板上大腸桿菌為粉紅菌落光滑型菌落粗糙型菌落2、細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象均勻混濁：大多數(shù)細(xì)菌沉淀：少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌。如鏈球菌菌膜：結(jié)核分枝桿菌、銅綠假單胞菌等專性需氧菌呈表面生長。細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌膜菌沉淀對照3、細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴散生長，穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊緣清晰。細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力現(xiàn)象無動力現(xiàn)象工業(yè)菌種的分離和純培養(yǎng)技術(shù)項目一工業(yè)微生物菌種的分離技術(shù)任務(wù)一無菌技術(shù)防止實驗操作過程中其被其他微生物污染，其自身也不污染操作環(huán)境的技術(shù)。實驗操作過程：分離、轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)純培養(yǎng)物等。1微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌培養(yǎng)皿試管三角瓶塞子滅菌（讓容器內(nèi)不含任何生物）2無菌接種操作最常用的基本操作。

要點：在火焰附近熟練操作；在無菌操作箱操作；在無菌操作室（無菌間）操作。接種環(huán)接種針無菌吸管移液槍3獲得純培養(yǎng)的方法固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)平板（cultureplate）或平板（plate）

菌落（colony）試管

菌苔（lawn）獲得獲得菌落菌苔液體培養(yǎng)基沉淀生長混濁生長表面生長平板劃線分離法稀釋法單胞子或單細(xì)胞分離法利用選擇性培養(yǎng)基分離法任務(wù)二純培養(yǎng)物分離方法稀釋法稀釋倒平板法:菌懸液稀釋—不同梯度的稀釋液少許與培養(yǎng)基混合—搖勻—倒培養(yǎng)皿中稀釋混合平板法：稀釋—培養(yǎng)皿中加入不同梯度的菌懸液1mL—加45℃左右的培養(yǎng)基—搖勻稀釋涂布平板法：倒平板----稀釋----接種0.1mL—涂布單胞子或單細(xì)胞分離法采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細(xì)胞或單個個體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。操作技術(shù)要求比較高，要用顯微操作儀或特制毛細(xì)管利用選擇性培養(yǎng)基分離法利用選擇培養(yǎng)基直接分離根據(jù)待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件