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1偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型三重熒光PCR檢測方法本文件適用于偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型的4縮略語PRV:偽狂犬病毒(PorcinePsPPV:豬細小病毒(PorcineParvoviPCV-2:豬圓環(huán)病毒2型(PorcineFAM:6-羧基熒光素(6-CarboxyfluoresceHex:六氯-6-甲基熒光素(6-HexachlBHQ:熒光淬滅基團2多通道熒光PCR儀、生物安全柜、冰箱(2℃~6℃和-20℃)、臺式冷凍離心機、組織勻漿機、漩渦6試劑和材料6.1病毒總核酸提取試劑TIANampVirusDNA/R照GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗含偽狂犬病毒(PRV)gE基因的體外重組質粒、含豬細小病毒(PPV)NS1基因的體外重組質粒、含豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)ORF2基因的體外重組質粒,序列片引物和探針序列見附錄B。7病料采集和處理8病毒總核酸的提取表1一步法多重熒光PCR反應體系(總體積20uL)2×IQPowermixPCR緩沖液1×35注:1.引物混合物指的是3種病原引物9.2熒光PCR反應程序9.3結果描述及判定9.3.1質控標準所有陽性對照(FAM、Cy5和Hex)均有S形擴增曲線,陰性對照(FAM、Cy5和Hex)均無9.3.2結果判斷和鑒別有擴增曲線,但35<Ct<40,屬于疑似區(qū)間,需要重新確認,建議使用單熒光PCR方法確認;如果Ct值仍然<40,則判定為核酸檢測陽性,如果Ct值≥FAM陽性熒光信號表示PCV-2核酸檢測陽性,Cy5陽性熒光信號表示PRV核酸檢測陽性,Hex陽性熒光信號表示PPV核酸檢測陽性;兩種陽性熒光信號表示對應的其中兩種病毒核酸檢測陽性,三種陽性熒光45ggccacgcccaacgacacgggcctctacacgctgcacgacgcctcggggccgcgggccgtgttctttgtggcggtgggcgaccggccgcccgcgccggcggacccggtgggccccgcgcgccacgagccccgcttccacgcgctcggcttccactcgcagctcttctcgcccggggacacgttcgacctgatgccgcgcgtggtctcggacatgggcgactcgcgcgagaactttaccgccacgctggactggtactacgcgcgcgcgcccccgcggtgcctgctgtactacgtgtacgagccctgcatctaccacccgcgcgcgcccgagtgcctgcgcccggtggacccggcgtgcagcttcacctcgccggcgcgcgcgcggctggtggcgcgccgaaagaccagaacatacacaaccaataagagacagaatgttaaacataaacctaaccagaaaactgccaggtgattttggacttttagaagaaactgaatggccactaatatgtgcttggttggtaaagaaaggttaccaagcaacaatggctagctatatgcatcattggggaaatgtacctgattggtcagaaaaatgggaggagccaaaaatgcaaaccccaataaatacaccaacagactctcagatttccacatcagtgaaaacttcgccagcggacaacaactacgcagcaactccaatacaggaggacctggatttagctttagccttggagccgtggagcgagccaacaacaccaactttcaccaacctgcacttaactccaacaccgccagattcagcaatacggacaccaagtccaacttggtcggaaatagaaaccgacataagagcctgctttggtgaaaactgtgcacccacaacaaaccttgaataatctgaattgtacatacatggttacacggatattgtattcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttccagcagtttgtagtctcagccacagctgatttcttttgttgtttggttggaagtaatcaatagtggaatctaggacaggtttgggggtaaagtagcgggagtggtaggagaagggctgggttatggtatggcgggaggagtagtttacataggggtcataggtgagggctgtggcctttgttacaaagttatcatctagaataacagcactggagcccactcccctgtcaccctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagtattcaaagggcacagagcgggggtttgagccccctcctgggggaagaaagtcattaatattgaatctcatcatgtccaccgcccaggagggcgttttgactgtggttcgcttgatagtatatccgaaggtgcgggagaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggt6aacggtggcgggggtggacgagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggggcggtgtcttcttctccggtaacgcctccttggatacgtcat7besgENS185.加入250μL無水乙醇,渦旋振蕩15se

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