偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型三重熒光PCR檢測方法

1偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型三重熒光PCR檢測方法本文件適用于偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型的4縮略語PRV：偽狂犬病毒（PorcinePsPPV：豬細小病毒（PorcineParvoviPCV-2：豬圓環(huán)病毒2型（PorcineFAM:6-羧基熒光素(6-CarboxyfluoresceHex：六氯-6-甲基熒光素（6-HexachlBHQ：熒光淬滅基團2多通道熒光PCR儀、生物安全柜、冰箱（2℃~6℃和-20℃)、臺式冷凍離心機、組織勻漿機、漩渦6試劑和材料6.1病毒總核酸提取試劑TIANampVirusDNA/R照GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗含偽狂犬病毒（PRV）gE基因的體外重組質(zhì)粒、含豬細小病毒（PPV）NS1基因的體外重組質(zhì)粒、含豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）ORF2基因的體外重組質(zhì)粒，序列片引物和探針序列見附錄B。7病料采集和處理8病毒總核酸的提取表1一步法多重熒光PCR反應(yīng)體系（總體積20uL）2×IQPowermixPCR緩沖液1×35注：1.引物混合物指的是3種病原引物9.2熒光PCR反應(yīng)程序9.3結(jié)果描述及判定9.3.1質(zhì)控標準所有陽性對照（FAM、Cy5和Hex）均有S形擴增曲線，陰性對照（FAM、Cy5和Hex）均無9.3.2結(jié)果判斷和鑒別有擴增曲線，但35<Ct<40，屬于疑似區(qū)間，需要重新確認，建議使用單熒光PCR方法確認；如果Ct值仍然<40，則判定為核酸檢測陽性，如果Ct值≥FAM陽性熒光信號表示PCV-2核酸檢測陽性，Cy5陽性熒光信號表示PRV核酸檢測陽性，Hex陽性熒光信號表示PPV核酸檢測陽性；兩種陽性熒光信號表示對應(yīng)的其中兩種病毒核酸檢測陽性，三種陽性熒光45ggccacgcccaacgacacgggcctctacacgctgcacgacgcctcggggccgcgggccgtgttctttgtggcggtgggcgaccggccgcccgcgccggcggacccggtgggccccgcgcgccacgagccccgcttccacgcgctcggcttccactcgcagctcttctcgcccggggacacgttcgacctgatgccgcgcgtggtctcggacatgggcgactcgcgcgagaactttaccgccacgctggactggtactacgcgcgcgcgcccccgcggtgcctgctgtactacgtgtacgagccctgcatctaccacccgcgcgcgcccgagtgcctgcgcccggtggacccggcgtgcagcttcacctcgccggcgcgcgcgcggctggtggcgcgccgaaagaccagaacatacacaaccaataagagacagaatgttaaacataaacctaaccagaaaactgccaggtgattttggacttttagaagaaactgaatggccactaatatgtgcttggttggtaaagaaaggttaccaagcaacaatggctagctatatgcatcattggggaaatgtacctgattggtcagaaaaatgggaggagccaaaaatgcaaaccccaataaatacaccaacagactctcagatttccacatcagtgaaaacttcgccagcggacaacaactacgcagcaactccaatacaggaggacctggatttagctttagccttggagccgtggagcgagccaacaacaccaactttcaccaacctgcacttaactccaacaccgccagattcagcaatacggacaccaagtccaacttggtcggaaatagaaaccgacataagagcctgctttggtgaaaactgtgcacccacaacaaaccttgaataatctgaattgtacatacatggttacacggatattgtattcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttccagcagtttgtagtctcagccacagctgatttcttttgttgtttggttggaagtaatcaatagtggaatctaggacaggtttgggggtaaagtagcgggagtggtaggagaagggctgggttatggtatggcgggaggagtagtttacataggggtcataggtgagggctgtggcctttgttacaaagttatcatctagaataacagcactggagcccactcccctgtcaccctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagtattcaaagggcacagagcgggggtttgagccccctcctgggggaagaaagtcattaatattgaatctcatcatgtccaccgcccaggagggcgttttgactgtggttcgcttgatagtatatccgaaggtgcgggagaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggt6aacggtggcgggggtggacgagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggggcggtgtcttcttctccggtaacgcctccttggatacgtcat7besgENS185.加入250μL無水乙醇，渦旋振蕩15se