培養(yǎng)基配制技術(shù)（藥品生物檢定課件）

一、水分水是微生物細(xì)胞的重要組成部分，其含量約為70%～90%，微生物細(xì)胞中的水分常以游離水和結(jié)合水兩種狀態(tài)存在，且游離水含量是結(jié)合水的四倍，兩者在細(xì)胞中所起的生理作用不同。結(jié)合水是指由于水與溶質(zhì)或其它分子結(jié)合而不能被微生物所利用的水分，結(jié)合水不能流動，不易蒸發(fā)，不凍結(jié)，不能滲透，也不能作為溶劑，因此結(jié)合水不具有一般水的特性，常束縛于原生質(zhì)的膠體體系之中，成為細(xì)胞物質(zhì)的組成成分，是微生物細(xì)胞生長發(fā)育的必要條件之一。游離水是指能被微生物所利用的水，其性質(zhì)與結(jié)合水相反，具有一般水的特性，能流動，能自由地出入細(xì)胞，它是微生物進行代謝活動的介質(zhì)，同時還直接參與一部分生化反應(yīng)。營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、代謝產(chǎn)物與能量的排出均是以水為媒介的。因為水的比熱高，是熱的良好導(dǎo)體，能有效地吸收代謝過程中產(chǎn)生的熱并及時地將熱迅速散發(fā)出體外，從而有效地控制細(xì)胞內(nèi)溫度的變化。保持充足的水分是細(xì)胞維持自身正常形態(tài)的重要因素。微生物通過水合作用和脫水作用控制由多亞基組成的結(jié)構(gòu)，如酶、微管、鞭毛及病毒顆粒的組裝與解離。微生物離開了水就不能進行生命活動。二、碳源物質(zhì)凡一切能滿足微生物生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)統(tǒng)稱為碳源物質(zhì)。由此可知，糖、醇、有機酸（包括氨基酸）、脂肪、烴類甚至二氧化碳或碳酸鹽類均可以作為微生物的碳源物質(zhì)。其中二氧化碳和碳酸鹽是無機含碳化合物，其余均為有機含碳營養(yǎng)物質(zhì)。碳源物質(zhì)通過細(xì)胞內(nèi)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，形成細(xì)胞物質(zhì)、形成各種代謝產(chǎn)物和細(xì)胞貯藏物質(zhì)，為微生物進行生命活動提供能量。糖類是最常用的碳源物質(zhì)，主要有單糖、寡糖和多糖。在單糖中，幾乎每種微生物都能利用葡萄糖和果糖，但對甘露糖和半乳糖的利用速度較慢，對戊糖（如木糖、阿拉伯糖）的利用不如己糖普遍。寡糖又叫低聚糖，是由二至十個相同或不同的單糖單位以α-或β-糖苷鍵連接而組成的。其中最主要的是雙糖或三糖，雙糖中的蔗糖和麥芽糖是微生物普遍能利用的碳源，三糖中棉子糖能被許多真菌利用。多糖是由十種以上單糖單位以與寡糖同樣的組成原則形成的分枝或不分枝的大分子碳水化合物，包括淀粉、纖維素、半纖維素等。重要的有阿拉伯聚糖，木聚糖、葡聚糖、半乳聚糖、果聚糖和甘露聚糖、甲殼質(zhì)（由N-乙酰氨基葡萄糖單位以β-1，4葡萄糖苷鍵相連而成）和果膠質(zhì)（由半乳糖醛酸殘基以α-1，4葡萄糖苷鍵相連而成）等。淀粉是大多數(shù)微生物均可利用的碳源，果膠、半纖維素也可被許多微生物產(chǎn)生的胞外酶分解。纖維素較難被微生物分解，能分解纖維素的微生物主要是霉菌，如木霉、根霉、曲霉、青霉等；在細(xì)菌和放線菌中也發(fā)現(xiàn)有少數(shù)能分解纖維素的菌種。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中所提供的碳源，大多數(shù)來自植物體，如山芋粉、玉米粉、麩皮、米糠、糖蜜等，其成分以碳源為主，但也包含其他營養(yǎng)成分。實驗室中，常用于微生物培養(yǎng)基的碳源主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、甘油和有機酸等。三、氮源物質(zhì)凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)均稱為氮源。氮源對微生物的生長發(fā)育有著重要作用，它是構(gòu)成微生物細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，也是微生物含氮代謝產(chǎn)物的組成元素。氮源可分為氮氣、無機氮化合物和有機氮化合物，不同類型的微生物由于營養(yǎng)生理的差異，因此對氮源的需要有很大不同。大氣中分子態(tài)氮只有固氮微生物可以利用，它們把分子態(tài)氮合成自身的氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等。有固氮能力的微生物主要是原核微生物，一類是與高等植物共生的，稱為共生固氮菌，包括與豆科植物根部細(xì)胞共生的根瘤菌、與非豆科植物（如赤楊、楊梅等）共生的放線菌弗蘭克氏菌，另一類是自生固氮微生物，主要是藍(lán)細(xì)菌和固氮細(xì)菌。無機氮源主要是硝酸鹽和銨鹽，絕大多數(shù)微生物可以利用無機氮源。只有銨離子才能直接進入有機分子中，硝酸鹽必須先還原成NH4+離子后，才能用于生物合成。當(dāng)利用無機氮化合物為唯一氮源培養(yǎng)微生物時，培養(yǎng)基有可能表現(xiàn)生理酸性或生理堿性。例如，以硫酸銨為氮源時，由于NH4+被吸收，SO42-殘留下來，造成培養(yǎng)基pH值下降，故有“生理酸性鹽”之稱。當(dāng)以硝酸鉀為氮源時，由于NO3-離子被還原利用，會使培養(yǎng)基pH值上升，故有“生理堿性鹽”之稱。因此，應(yīng)在培養(yǎng)基中添加緩沖物質(zhì)以穩(wěn)定pH值。大多數(shù)寄生性微生物和部分腐生性微生物可以利用有機氮化合物。實驗室和發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中常用的有機氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、魚粉、血粉、蠶蛹粉、豆餅粉等。蛋白質(zhì)一般不是微生物的良好的有機氮源，但某些微生物可以通過自身分泌的胞外蛋白水解酶將蛋白質(zhì)降解后加以利用，因此含蛋白質(zhì)的有機氮源稱為遲效性氮源；而無機氮源或以蛋白質(zhì)的各種降解產(chǎn)物形式存在的有機氮源則被稱為速效氮源。四、無機鹽類由微生物細(xì)胞成分分析可知，無機元素是微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)不可或缺的成分之一，占細(xì)胞干重百分之幾，也是生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，許多無機元素構(gòu)成酶的活性基團或充當(dāng)酶的激活劑，有些無機元素具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓、酸堿度、氧化還原電位及能量轉(zhuǎn)移等作用。因此，除了含氮無機鹽可以作微生物的營養(yǎng)物質(zhì)外，含其它的無機元素的鹽類也是微生物生長所必須的營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)無機元素需要量的不同，將其分為大量元素和微量元素。凡生長所需濃度在10-3～10-4mol/L范圍內(nèi)的元素，稱為大量元素，如P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等。磷是核酸、磷脂、核蛋白、輔酶和高能磷酸化合物的成分，在細(xì)胞內(nèi)參與物質(zhì)和能量代謝過程，磷以無機磷酸根的形式被吸收。硫是胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸組成成分，也是一些輔酶的活性基，如輔酶A、生物素、硫辛酸、谷胱甘肽中也含有硫。硫以SO42-的形式被吸收，少數(shù)微生物失去了還原硫酸鹽的能力，需要供給還原型的硫化物（如H2S和半胱氨酸）才能生長。鎂并不參與任何其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只是以離子狀態(tài)激活許多酶的反應(yīng)（如己糖激酶）。其激活作用有時可被Mn2+代替。此外，鎂離子濃度在控制核蛋白體的聚合作用起著重要的作用。鉀不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，但它是許多酶的激活劑，可以促進碳水化合物的代謝，也控制原生質(zhì)的膠態(tài)和細(xì)胞質(zhì)膜的透性。鈉可能與維持滲透壓有關(guān)。鈣不參與微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而以離子狀態(tài)存在于細(xì)胞中，控制細(xì)胞的生理狀態(tài)，如調(diào)節(jié)質(zhì)膜的透性，激活某些酶（如蛋白酶），對一些陽離子的毒性有拮抗作用。凡生長所需濃度在10-6～10-8mol/L范圍內(nèi)的元素，則稱微量元素，如Mn、Zn、Cu、Cl、Co、Mo、Ni、B、W、Sn、Se等。微量元素與酶的活動密切有關(guān)，常是酶的活性基的成分，也是酶的激活劑。如鐵是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶等的活性基的組成成分；銅是多酚氧化酶和抗壞血酸氧化酶的活性基；鋅是乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶的活性基；鈷參與微生物B12輔酶的組成，鉬參與硝酸還原酶和固氮酶的結(jié)構(gòu)；錳是多種酶的激活劑，有時可以代替Mg2+起激活劑作用。過量的微量元素會起毒害作用，特別是只有某單一微量元素存在時，毒害更嚴(yán)重。各種微量元素之間應(yīng)有恰當(dāng)?shù)谋壤P(guān)系。由于這些微量元素?；旌谄渌鼱I養(yǎng)物和水中，所以培養(yǎng)基中一般不另行添加。五、生長因子通常微生物生長所必需、其自身又不能合成或合成量不足以滿足自身生長，需要外源提供的微量有機物統(tǒng)稱為生長因子，其中包括氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶及它們的衍生物、脂肪酸及其它膜成分。各種微生物與生長因子的關(guān)系可分以下幾類：1．生長因子自養(yǎng)型微生物它們不需要從外界吸收任何生長因子，多數(shù)真菌、放線菌和多數(shù)細(xì)菌都屬這一類。如E．coli（大腸桿菌）等。2．生長因子異養(yǎng)型微生物它們需要從外界吸收多種生長因子才能維持正常生長，如各種乳酸菌、動物致病菌、支原體和原生動物等。3．生長因子過量合成微生物少數(shù)微生物在其代謝活動中，能合成并分泌出大量的維生素等生長因子，可作為有關(guān)維生素的生產(chǎn)菌種。通常由于對某些微生物所需的生長因子不了解，因此常在培養(yǎng)這些微生物的培養(yǎng)基里加入酵母膏、牛肉膏、玉米漿、肝浸液、麥芽汁或其他新鮮的動植物組織浸出液等物質(zhì)以滿足它們對生長因子的需要。謝謝

簡單擴散：簡單擴散或自由擴散是營養(yǎng)物質(zhì)通過細(xì)胞膜中的含水小孔由高濃度的胞外環(huán)境向底濃度的胞內(nèi)網(wǎng)狀的轉(zhuǎn)運過程，這種擴散是非特異性的但膜上小孔的大小和形狀對被滲透擴散的營養(yǎng)物質(zhì)的分子大小有一定的選擇性。簡單擴散的限制因素主要是物質(zhì)的脂溶性、分子大小和帶電性。

簡單擴散示意圖促進擴散又稱易化擴散、協(xié)助擴散，或幫助擴散，是指非脂溶性物質(zhì)或親水性物質(zhì),如氨基酸、糖、核苷酸和金屬離子等借助細(xì)胞膜上的膜蛋白的幫助順濃度梯度或順電化學(xué)濃度梯度,不消耗ATP進入膜內(nèi)的一種被動運輸過程。其轉(zhuǎn)運方式分為兩種：一是載體轉(zhuǎn)運；二是通道轉(zhuǎn)運。

主動運輸：是指物質(zhì)逆濃度梯度，在載體蛋白和能量的作用下將物質(zhì)運進或運出細(xì)胞膜的過程。Na+、K+和Ca2+等離子，都不能自由地通過磷脂雙分子層，它們從低濃度一側(cè)運輸?shù)礁邼舛纫粋?cè)，需要載體蛋白的協(xié)助，同時還需要消耗細(xì)胞內(nèi)化學(xué)反應(yīng)所釋放的能量基團移位

離子泵：

膜運輸?shù)鞍字?。也看作一類特殊的載體蛋白，能驅(qū)使特定的離子逆電化學(xué)梯度穿過質(zhì)膜，同時消耗ATP形成的能源，屬于主動運輸。離子泵本質(zhì)是受外能驅(qū)動的可逆性ATP酶。外能可以是電化學(xué)梯度能、光能等。被活化的離子泵水解ATP，與水解產(chǎn)物磷酸根結(jié)合后自身發(fā)生變構(gòu)，從而將離子由低濃度轉(zhuǎn)運到高濃度處，這樣ATP的化學(xué)能轉(zhuǎn)變成離子的電化學(xué)梯度能。目前已知的離子泵有多種，每種離子泵只轉(zhuǎn)運專一的離子。細(xì)胞內(nèi)離子泵主要有鈉鉀泵、鈣泵和質(zhì)子泵?；鶊F移位：

是指被輸送的營養(yǎng)物質(zhì)分子在膜內(nèi)經(jīng)過共價修飾，以被修飾的形式進入細(xì)胞質(zhì)的輸送過程。由于這種輸送是在磷酸基團發(fā)生移位的過程中完成的，故有稱之為基團移位。因為在輸送過程中消耗了磷酸烯醇式丙酮酸上的高能磷酸鍵的鍵能，所以這種輸送也屬于主動輸送。謝謝培養(yǎng)基的概念

培養(yǎng)基是指人工配制并滅菌的，適合微生物生長繁殖或生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的，用于微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存的混合營養(yǎng)基質(zhì)。因此，培養(yǎng)基必須具備微生物所需要的碳、氮、磷、硫等大量元素及微量元素、生長因子及水等，保持一定的參透壓，維持適合pH值，呈現(xiàn)適當(dāng)?shù)奈锢砗蜔o菌狀態(tài)。

培養(yǎng)基分類：按成分劃分

（1）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基含有各種天然物質(zhì)，其成分及含量不確定，如蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米漿、麥芽浸膏等

（2）合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是由已知化學(xué)成分的營養(yǎng)物質(zhì)組成的。由于微生物對營養(yǎng)要求的不同，它可以完全由無機鹽或無機鹽加有機化合物組成。（3）半合成培養(yǎng)基由部分天然材料和部分化學(xué)藥品組成的培養(yǎng)基稱為半合成培養(yǎng)基。由于多數(shù)微生物均能在此類培養(yǎng)基上生長，配制方便，成本低廉，所以生產(chǎn)或?qū)嶒炛薪?jīng)常用半合成培養(yǎng)基。按物理狀態(tài)劃分

（1）液體培養(yǎng)基用各種材料的抽提物或化學(xué)試劑按照一定比例配成的水溶液或液體狀態(tài)的營養(yǎng)基質(zhì)叫液體培養(yǎng)基，微生物在液體培養(yǎng)基中靜止生長時，需氧微生物往往可在液面形成膜、島、環(huán)，而液體仍清晰透明；厭氧或兼性厭氧微生物生長而導(dǎo)致液體混濁或有沉淀。

（2）固體培養(yǎng)基除了用固體物料加水或營養(yǎng)鹽構(gòu)成的疏松固體培養(yǎng)基（如曲、固體酶制劑、醬）外，固體培養(yǎng)基主要是指在液體培養(yǎng)基中加入一定量的固化膠體物質(zhì)而配制成的胨狀培養(yǎng)基。將微生物細(xì)胞接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能形成一定特征的菌落或菌苔。固體培養(yǎng)基對于研究微生物的分離、純化、培養(yǎng)、保存、鑒定等均是不可缺少的。

按用途劃分

（1）.基礎(chǔ)培養(yǎng)基是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基也可以作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分，再根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)需求，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入所需營養(yǎng)物質(zhì)而制成特殊培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

（2）富集培養(yǎng)基也稱營養(yǎng)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，這些特殊營養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動植物組織液等。富集培養(yǎng)基常用于營養(yǎng)要求苛刻的異養(yǎng)微生物的培養(yǎng)。

（3）鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種特殊化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，根據(jù)這種特征性變化，可將該種微生物與其他微生物區(qū)分開來。

（4）選擇培養(yǎng)基是用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。根據(jù)不同種類微生物的特殊營養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長。配制培養(yǎng)基的基本原則

一、根據(jù)微生物的營養(yǎng)特點選擇營養(yǎng)物質(zhì)

微生物營養(yǎng)類型不同對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不同，因此依據(jù)不同微生物的營養(yǎng)要求配制適宜的培養(yǎng)基是配制培養(yǎng)基的基本原則之一。

自養(yǎng)型微生物能從簡單的無機物合成自身的有機體，因此培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基可以由簡單的無機物組成。例如氧化硫硫桿菌培養(yǎng)基組成中，只有CO2、(NH4)2SO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、CaCL2、S和水等無機物，沒有加入任何有機化合物。多數(shù)藻類也是自養(yǎng)型微生物，它們的培養(yǎng)基組成也比較簡單，只需要無機營養(yǎng)物質(zhì)而不需要有機營養(yǎng)物質(zhì)。但是培養(yǎng)異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基需要添加無機物和有機物，而且不同類型的異養(yǎng)型微生物的營養(yǎng)要求差異很大。如培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基組成簡單，而培養(yǎng)腸膜明串珠菌的培養(yǎng)基成分非常復(fù)雜，僅生長因子多達(dá)33種。原生動物也是異養(yǎng)型微生物，需要較多的營養(yǎng)物質(zhì)，如梨形四膜蟲的培養(yǎng)基含有10種氨基酸、7種維生素、鳥嘌呤、尿嘧啶及一些無機鹽等。二、控制營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例

營養(yǎng)物質(zhì)濃度過低不能滿足微生物正常生長所需，太高則可能對微生物產(chǎn)生毒害，如高濃度的無機鹽、重金屬離子等會抑菌或殺菌。因此，營養(yǎng)物質(zhì)合適的濃度是微生物生長發(fā)育的必要條件之一。在生產(chǎn)過程中，在不影響微生物的生理特性和代謝轉(zhuǎn)化率的情況下，通常趨向在較高濃度下進行生產(chǎn)，以提高產(chǎn)物產(chǎn)量，并盡可能選育高滲透壓的生產(chǎn)菌株。當(dāng)然，培養(yǎng)基濃度太大會使培養(yǎng)基黏度增加和溶氧量降低。

營養(yǎng)物質(zhì)之間應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤绕渑囵B(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的碳氮比(C／N)在微生物培養(yǎng)中尤其重要。不同菌種、不同發(fā)酵產(chǎn)物所要求的碳氮比是不同的。菌體在不同生長階段，對其碳氮比的要求也不一樣。氮源過多，則菌體繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產(chǎn)量。碳源過多，則容易形成較低的pH值；碳源不足，菌體衰老和自溶。三、控制酸堿度

各種微生物正常生長均有合適的pH值，一般霉菌和酵母菌比較適于微酸性環(huán)境，放線菌和細(xì)菌適于中性或微堿性環(huán)境。為此，當(dāng)培養(yǎng)基配制好后，若pH值不合適，必須加以調(diào)節(jié)。

四、控制氧化還原電位

不同微生物對氧化還原電位的要求不同，一般地，好氧型微生物氧化還原電位值大于+0.1V，最適值是+0.3～+0.4V，厭氧型微生物氧化還原電位值小于+0.1V。氧化還原電位的高低受氧氣分壓、pH值和微生物代謝產(chǎn)物的影響。通常增加通氣量或加入氧化劑，可以增加氧化還原電位值，加入還原劑如抗壞血酸、硫化氫、谷胱甘肽等可降低氧化還原電位值。

五、就地取材

在大規(guī)模生產(chǎn)中培養(yǎng)基用量很大，在選用培養(yǎng)基原料時應(yīng)就地取材，盡量地利用當(dāng)?shù)剌^豐富的廉價原料，設(shè)法降低成本。例如，賴氨酸生產(chǎn)中先選用山芋淀粉，后改為用山芋粉為碳源，這樣不僅價廉，而且山芋粉中還含有生物素、鎂鹽等，省去了原來所加的玉米漿、硫酸鎂，并使整個成本降低15％。六、滅菌處理

培養(yǎng)基混有環(huán)境中各種雜菌，必須對培養(yǎng)基滅菌才能避免外來雜菌的干擾。對培養(yǎng)基滅菌一般采用高壓蒸汽滅菌法，在121℃下維持15～30分鐘即可達(dá)到滅菌目的。

在高壓蒸汽滅菌過程中，長時間高溫會使不耐熱的糖類遭到破壞，形成氨基糖、焦糖。因此含糖培養(yǎng)基常在112℃下進行滅菌或過濾除菌后再與已滅菌的成分混合使用。長時間高溫還引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽離子結(jié)合，形成難溶性復(fù)合物，因此，常在培養(yǎng)基中加入少量螯合劑（如EDTA）或?qū)l(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)分開滅菌后混合都可以避免產(chǎn)生沉淀。培養(yǎng)基中泡沫的存在也對滅菌極為不利，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入消泡劑，減少或避免泡沫的產(chǎn)生謝謝高氏一號培養(yǎng)基配方

可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCL0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH=7.4～7.6。制備流程及注意事項

1、稱量和溶化按配方和培養(yǎng)基需用量計算并稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后再稱取其他各成分，并依次溶化，對微量成分FeSO4·7H2O可先配成0.01g/mL的貯備液，按比例換算后再加入。待所有試劑完全溶解后，補充水分到所需的總體積。配制固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放入已溶解的試劑中，再加熱融化，最后補足水分。2、調(diào)pH用試紙測培養(yǎng)基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中加入1mol/LNaOH,邊滴邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH,直至pH達(dá)7.6。反之，用1mol/LHCL進行調(diào)節(jié)。

3、分裝和加塞將配制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)，剩余的培養(yǎng)基裝入三角瓶中，在試管口或錐形瓶口上塞上棉塞。4、包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，其外再用一根麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。

5、滅菌將上述培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋，以121℃,0.103MPa高壓蒸汽滅菌20～30min。

6、擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，將試管口端擱在玻璃棒上。斜面的斜度要適當(dāng)，使斜面的長度約為管長1/3～1/2。

7、無菌檢查將滅菌培養(yǎng)基放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～28h，以檢查滅菌是否徹底，如果無菌生長即為滅菌完全。

謝謝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方：

牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCL5.0g，瓊脂15～20g，水1000ml，pH7.4～7.6。其中牛肉膏提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨提供氮源和維生素，而NaCL提供無機鹽，在配制固體培養(yǎng)基時需要加入一定量瓊脂作凝固劑，如果配制液體培養(yǎng)基則不用加入瓊脂。制備步驟及注意事項

1.稱量（假定配制1000ml培養(yǎng)基）

依據(jù)培養(yǎng)基配方及所需培養(yǎng)基總量，計算并準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL各自的量,放入燒杯（或鋼鍋）中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在稱量紙上，稱量后直接放人水中，稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。蛋白胨很容易吸濕，在稱取時動作要迅速。稱量時嚴(yán)防藥品混雜，如果用同一把角匙取用不同藥品時，稱取一種藥品后，將角匙洗凈擦干，再稱量另一藥品，同時瓶蓋也不要蓋錯。2.溶化

在燒杯（鋼鍋）中先加入所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積；如果配制固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補足所需水分。在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器，同時，不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。通常不用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長。3.調(diào)pH

在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol／LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直至pH達(dá)7.4～7.6。反之，用1mol／LHCl進行調(diào)節(jié)。對于要求pH較精確的培養(yǎng)基，其pH的調(diào)節(jié)常用酸度計進行。pH調(diào)節(jié)不要過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各物質(zhì)的濃度。

4.過濾

趁熱用多層紗布過濾，除去雜質(zhì)，以利實驗結(jié)果的觀察。不影響實驗結(jié)果時，可以省去過濾，本實驗不需過濾。5.分裝

液體培養(yǎng)基分裝高度以試管高度的1／4左右為宜，固體培養(yǎng)基不超過管高的1／5，半固體培養(yǎng)基以試管高度的1／3為宜。分裝三角瓶的雖則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜。有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染（6.加塞

培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅膠塞、金屬或高溫塑料試管帽等)，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內(nèi)面造成污染，并保證有良好的通氣性能。制作棉塞時，選用大小薄厚適中的普通棉花一塊，鋪展在左手拇指和食指形成的圓孔上，用右手食指將棉花從中央壓入圓孔中制成棉塞，直接壓入試管或三角瓶口。制成的棉塞要求不緊不松，兩頭光滑，試管棉塞的長度約3cm左右，塞入后，試管內(nèi)部分約占2/3，管外頭部占1/3左右7.包扎

試管加塞后，以10多支為一組，在棉塞外包一層牛皮紙包扎成捆（圖4-8），注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、配制人備用。三角燒瓶加塞后，外包