選1知識(shí)點(diǎn)總結(jié)

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2013選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》一輪復(fù)習(xí)知識(shí)梳理

專題1傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用

課題1果酒和果醋和制作

【補(bǔ)充知識(shí)】發(fā)薛

1、概念：利用微生物或其他生物的細(xì)胞在有氧或無氧條件下繁殖或積累其代謝產(chǎn)物的過程。

2.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)（都是采用自然發(fā)酵的工藝），如：傳統(tǒng)的前萄酒釀造，就是葡萄破碎入罐以后,

不人為地添加任何菌種，靠葡荀本身攜帶的自然界的酵母菌，在葡萄漿或分離后的葡萄汁里自發(fā)

地繁殖，最終發(fā)酵成葡萄酒。

3、類型：

⑴根據(jù)是否需要氧氣分為：需氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵,

⑵根據(jù)產(chǎn)生的產(chǎn)物可分為：酒精發(fā)酵、丸酸發(fā)薛、醋酸發(fā)酵等。

一、基礎(chǔ)知識(shí)

（~）果酒制作的原理

⑴果酒發(fā)酵的菌種：酵母菌,屬于真核生物

⑵酵母菌的代謝類型是：異界兼性厭氧型

有氧時(shí)，進(jìn)行有氧呼吸,反應(yīng)式為：CqHi2O9+6H2O+6O2T6co?+12點(diǎn)）+能量:大量繁殖，

無氧時(shí)，能進(jìn)行酒精發(fā)酵,反應(yīng)式為：C6Hl2。6符》2c2H5OH+2CS+能量。

⑶酵母菌的生殖方式：出芽生殖（主要）分裂生殖抱子生殖.

⑷酵母菌繁殖的最適溫度幺fC左右，酒精發(fā)酵一般控制在18?25C。

⑸傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)所使用的酵母菌的來源：主要是附著于葡萄皮上的野生型酵母菌。

也可以在果汁中加入人工培養(yǎng)的酵母菌°

注意：

①在發(fā)酵過程中,隨著酒精濃度的提高,紅葡萄皮的色素也進(jìn)入發(fā)酵液，使葡萄酒呈現(xiàn)深紅色.

②酒精發(fā)酵過程中，要保持缺氧、酸性環(huán)境。在缺氧呈酸性的發(fā)酵液中，酵母菌可以生長(zhǎng)繁殖，

而絕大多數(shù)其他微生物都因無法適應(yīng)這一環(huán)境而受到制約。

③.酒精發(fā)酵過程中，要“先通氣后密封”？“通氣”的目的是使酵母菌進(jìn)行有氧呼吸大量繁殖，“密封”

的目的是使酵母菌進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生酒精，

（二）果醋制作的原理

⑴菌種是醋酸菌,屬于原核生物

⑵醋酸菌的代謝類型為異養(yǎng)需氧型。

有兩條途徑生成醋酸：直接氧化和以酒精為底物的氧化。

當(dāng)氧氣、糖源都充足時(shí)，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸,當(dāng)缺少糖源時(shí)，醋酸菌將乙醇變?yōu)橐胰?

再將乙醛變?yōu)榇姿?反應(yīng)簡(jiǎn)式為C2H5OH+O2TCH贊OOH+HzO。

⑶醋酸菌的生殖方式：生殖方式為二分裂.

⑷醋酸菌最適生長(zhǎng)溫度為30?35℃0

⑸菌種來源：到生產(chǎn)食醋的工廠或菌種保藏中心購買,或從盒盤中分離醋酸菌。

注意：

①醋酸菌對(duì)氧氣的含量特別敏感，當(dāng)進(jìn)行深層發(fā)酵時(shí)，即使只是短時(shí)間中斷通入氧氣，也會(huì)引起醋酸菌死

亡。只有在氧氣充足時(shí)，才能進(jìn)行旺盛的生命活動(dòng)。變酸的酒表面觀察到的菌膜就是蠅菌在液面大量繁

殖形成的。

②醋酸菌最適生長(zhǎng)溫度為30?35C。,控制好發(fā)酵溫度，使發(fā)酵時(shí)間縮短，又減少雜菌污染的機(jī)會(huì)。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

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1、流程圖

捷選葡萄f之選f蚯一遒慧發(fā)酵一醋酸發(fā)酵

果酒果醋

充氣口是在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵進(jìn)行無工用的；使用該裝置制酒時(shí)，應(yīng)該關(guān)閉充

氣口；制醋時(shí)，應(yīng)將充氣口連接氣泵，輸入氧氣。

排氣口是在酒精發(fā)酵時(shí)用來排出c5的；排氣口要通過一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶

身連接，其目的是防止空氣中微生物的污染,其作用類似巴斯德的鵝頸瓶。

出料口是用來取樣的。

黑酒和央福的笈林裝置

2、制作實(shí)例

實(shí)驗(yàn)材料

葡萄、榨汁機(jī)、紗布、醋酸菌（或醋曲）、發(fā)酵瓶（如右圖）、氣泵、體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.對(duì)發(fā)酵瓶、紗布、榨汁機(jī)等實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行清洗并消毒。榨汁機(jī)要清洗干凈,并晾干。發(fā)酵瓶

要清洗干凈,用體積分?jǐn)?shù)為*的酒精消毒，晾干待用。

2.取葡萄500虱新鮮的葡萄）。

3.用清水沖洗葡萄1—2遍除去污物。（注意不用反復(fù)多次沖洗。）

（榨汁前應(yīng)該先沖洗,然后再除去枝梗,以避免除去枝梗時(shí)引起葡萄破損，增加被雜菌污

染的機(jī)會(huì)。）

4.用榨汁機(jī)榨取葡萄汁后，將其裝入發(fā)酵瓶中。（如果沒有合適的發(fā)酵裝荒，可用500mL的

塑料瓶替代。但注入的果汁量不要超過塑料瓶總體積的2Z3o要留出大約此的空間。）裝入

葡萄汁后，封閉充氣口。

5.將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度（18—25℃）下發(fā)酵。

6.由于發(fā)酵旺盛期CCh的產(chǎn)量非常多，因此需要及時(shí)排氣,以防止發(fā)酵瓶爆裂。（如果是簡(jiǎn)易發(fā)酵裝置，

每天擰松瓶蓋2?4次。進(jìn)行排氣。）

7.而天后（此:!卻左右），取樣檢驗(yàn)。例如，可以檢驗(yàn)酒味、酒精的含量、進(jìn)行酵母菌的鏡檢等工作。

果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可以用重格酸鉀來檢驗(yàn)。在酸性條件下,重銘酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。

檢測(cè)時(shí)，先在試管中加入發(fā)酵液2mL,再滴入物質(zhì)的量的濃度為3moi/L的H2s（）0滴,振蕩混勻，最

后滴加常溫下飽和的重格酸紓?cè)芤?滴。振蕩試管，觀察顏色.

8.當(dāng)果酒制成以后，可在發(fā)酵液中加入醋酸菌（或醋曲），然后移至前一35e條件下發(fā)酵,時(shí)間控制

在7?8d左右,適時(shí)用氣泵向發(fā)酵液中充氣。（如果沒有充氣裝置，可以將瓶蓋打開，在瓶口上蓋上紗布。

以減少空氣中塵土等的污染。）

注意：

⑴應(yīng)該從發(fā)酵制作的過程進(jìn)行全曲的考慮防止發(fā)酵液被污染？如，榨汁機(jī)、發(fā)酵裝置要造選干凈；每次

排氣時(shí)只需擰松瓶蓋、不要完全揭開瓶蓋等。

⑵制葡萄酒時(shí)，溫度控制在18?25°C發(fā)。溫度是酵母菌生長(zhǎng)和發(fā)酵的重要條件。20c左右最適合酵母菌

繁殖。因此需要將溫度控制在其最適溫度范圍內(nèi)。制葡萄醋時(shí)，要將溫度控制在30?35醋酸菌是

嗜溫菌，最適生長(zhǎng)溫度為30?度C,因此要將溫度控制在30?359。

⑶制葡萄醋時(shí)，醋酸菌是好氧菌,在將酒精變?yōu)榇姿釙r(shí)需要皂的參與，因此要適時(shí)向發(fā)酵液中充氣。

（二）練習(xí)

2.提示：大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)需要進(jìn)行更為全面周詳?shù)目紤]，如原料的來源與選擇、菌種的培育與選擇、發(fā)酵的

設(shè)備、發(fā)酵條件的自動(dòng)化控制，以及如何嚴(yán)格控制雜菌污染；等等。此外，無論是葡萄酒或葡萄醋，實(shí)驗(yàn)

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時(shí)所檢測(cè)的發(fā)酵液，并非商品意義上的產(chǎn)品。在實(shí)際生產(chǎn)中還需沉淀過濾、滅菌裝瓶等獲得成品酒或醋。

葡萄酒還需在一定設(shè)施和條件下（如橡木桶和地窖）進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵，以獲得特定的風(fēng)味和色澤。

3.提示：需考慮廠房、設(shè)備投資、原材料采購、工人人數(shù)及工資、產(chǎn)品種類、生產(chǎn)周期、銷售渠道、利潤(rùn)

等問題。

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課題2腐乳的制作

一、基礎(chǔ)知識(shí)

腐乳制作的原理

⑴腐乳的發(fā)酵有多種微生物（如青霉、酵母、曲霉、毛霉等）的協(xié)同作用,其中起主要作用的是毛霎，它是

一種真核生物

⑵新陳代謝類型是異養(yǎng)需氧型。營(yíng)腐生生活。

毛霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酷可以將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸;脂肪酶可以將脂肪水解

成甘油和脂肪酸。與醇類作用生成酯，形成細(xì)膩、鮮香等豆腐乳特色。

⑶生殖方式是池子生殖。

⑷發(fā)酵的溫度為15-18℃

⑸菌種來源：傳統(tǒng)腐乳的生產(chǎn)中，豆腐塊上生長(zhǎng)的毛霉來自空氣中的毛客抱子?，F(xiàn)代的腐乳生產(chǎn)是在嚴(yán)格

的無菌條件下,將優(yōu)良斑菌種直接接種在豆腐上，這樣可以避免其他菌種的污染,保證產(chǎn)品的質(zhì)量。

注意：優(yōu)良菌種的選擇：不產(chǎn)生毒素；生長(zhǎng)繁殖快，且抗雜菌力強(qiáng)；生長(zhǎng)的溫度范圍大，不受季節(jié)的限

制；有蛋白酶、脂肪酶、肽酶等酶系；使產(chǎn)品氣味正常良好。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、實(shí)驗(yàn)流程

讓豆腐長(zhǎng)出毛霉一加起腌制一加乳湯裝瓶一密封腌制。

2、制作實(shí)例

實(shí)驗(yàn)材料：含水量70%的豆腐，粽葉，盤子，鹽，黃酒，米酒，糖，香辛料等，廣口玻璃瓶，高壓鍋等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.將豆腐切成3cmX3cmXlcm若干塊。所用豆腐的含水量為70%左右。

用含水量過高的豆腐制腐乳，不易成形，且影響毛霉有氧呼吸。

用含水量過少不利于毛霉生長(zhǎng)，毛霉生長(zhǎng)離不開水。

樣品水分含量（％）計(jì)算公式如下：

（烘干前容器和樣品質(zhì)量?烘干后容器和樣品質(zhì)量）/烘干前樣品質(zhì)量

2.將豆.腐塊平放在鋪有干粽葉的盤內(nèi)（粽葉可以提供菌種，并能起到保溫的作用），每塊豆腐等距離

排放，周圍留一定的室屋。豆腐上面再鋪上干凈的粽葉。氣候干燥時(shí)，將平盤用保鮮膜包裹，但不要封嚴(yán)，

以免濕度太高，不利于毛霉的生長(zhǎng)。

3.將平盤放在溫度為15?18℃的地方,毛霉逐漸生長(zhǎng)，大約5d后，豆腐上生長(zhǎng)的白毛是毛霉的亙

色菌絲。嚴(yán)格地說是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。

4.當(dāng)毛霉生長(zhǎng)旺盛，并呈淡黃色時(shí),去除保鮮膜及鋪在上面的粽葉，使豆腐塊的熱量和水分能夠迅

速散失，同時(shí)散去霉味，這一過程一般持續(xù)36h以上。

5.豆腐潦透后，將豆腐間的連在一起的菌絲拉斷，并整齊排在容器內(nèi)，準(zhǔn)備腌制。

6.長(zhǎng)滿毛霉的豆腐塊（以下稱毛坯）分層擺放，分層加鹽，并隨層高而增加鹽量,在接近瓶口表面

鹽要鋪厚一些，以防止雜菌污染，約腌制8d。（豆腐與鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為5：1）

鹽的作用

⑴抑制微生物的生長(zhǎng)，避免腐敗變質(zhì)

⑵析出水分，是豆腐變硬，在后期制作過程中不易酥爛

（3）.調(diào)味作用，給腐乳以必要的咸味

（4）.浸提毛酣菌絲上的蛋白酶。

鹽的濃度過低，不足以抑制微生物的生長(zhǎng),可能導(dǎo)致豆腐腐??；鹽的濃度過高，會(huì)影響腐乳的口味。

注意：先發(fā)酵后加鹽

7.將黃酒、米酒和糖、香辛料等混合制成鹵湯。鹵湯酒精含量控制在公%左右為宜。（鹵湯直接關(guān)系

到腐乳的色、香、味。）

乳湯中酒的含量應(yīng)控制在12%左右。酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，而且丕

足以抑制微生物生長(zhǎng),豆腐易腐敗，難以成塊。酒精含量過高，對(duì)蛋白酶的抑制作用也越大，腐乳成熟的

時(shí)間將會(huì)延長(zhǎng)。

酒的作用：

⑴防止雜菌污染以防腐

（2）與有機(jī)酸結(jié)合形成酯，賦予腐乳風(fēng)味

（3）.酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短有很大關(guān)系。

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香辛料的作用：

⑴調(diào)味作用，不能增加營(yíng)養(yǎng)。

⑵殺菌防腐作用

⑶參與并促進(jìn)發(fā)酵過程

8.將廣口玻璃瓶刷洗干凈，用高壓鍋在1000c蒸汽滅菌30min,將腐乳成坯擺入瓶中，裝瓶時(shí)要迅速小心;

加入鹵湯和輔料后，要用膠條將瓶口蜜封；封瓶時(shí)，最好將瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶口被污染。。

在常溫下，一般六個(gè)月即可以成熟。

注意、釀造腐乳的主要生產(chǎn)工序是將豆腐進(jìn)行前期發(fā)酵和后期發(fā)酵。

前期發(fā)酵的主要作用：1.創(chuàng)造條件讓毛霉生長(zhǎng)。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期發(fā)酵主要是前與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程，通過各種輔料與能的緩解作用，生成腐乳的香氣。

注意：

①用來腌制腐乳的玻璃瓶，刷干凈后要用流水消毒。

②吃腐乳時(shí)，你會(huì)發(fā)現(xiàn)腐乳外部有一層致密的“皮這層“皮''是前期發(fā)酵時(shí)在豆腐表面上生長(zhǎng)的苴絲（匍

匐菌絲），它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形?！捌ぁ睂?duì)人體無害。

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課題3制作泡菜并檢測(cè)亞硝酸鹽含量

一、泡菜制作原理

L菌種

⑴乳酸菌常見種類：乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。

⑵代謝類型:異養(yǎng)厭氧型，在無氧條件情況下,將葡萄糖分解成乳酸。

前

反應(yīng)式為：C6H1206―；一2c3H603+能量

⑶生殖方式分裂方式:二分裂

⑷培養(yǎng)溫度：常溫

⑸分布：分布廣泛，空名、土壤、植物體表、人或動(dòng)物的腸道

⑹應(yīng)用：常用于生產(chǎn)

注意：含抗生素牛奶不能生產(chǎn)酸奶的原因是抗生素能殺死乳酸菌。

2.腌制條件

時(shí)間

溫度

食鹽的用量水和鹽為4：1

溫度過直、食鹽用量不足以名，腌制時(shí)間過短，容易造成細(xì)菌大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。

3.亞硝酸鹽

⑴物理性質(zhì)：白色粉末、易溶于蟲。

⑵應(yīng)用：在食品生產(chǎn)中常用作食品添加劑O

⑶分布：自然界中分布廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，亞硝酸鹽在蔬菜中的平均含量約為4mg/kg,咸菜中平均含量在7mg/k

以上，而豆粉中的平均含量可達(dá)10mg/kg。

⑷對(duì)人體的影響：膳食中的亞硝酸鹽一般不危害人體健康，當(dāng)人體攝入總量達(dá)0.3~0.5g時(shí),會(huì)引起中毒；

當(dāng)攝入總量達(dá)組時(shí)，會(huì)引起死亡。

⑸我國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn):國(guó)家規(guī)定肉制品中不超過亞m3醬腌菜中不超過20mg/kg,嬰兒奶粉中不超過2mg/kge

⑹絕大多數(shù)亞硝酸鹽隨尿液排出，但在特定條件下，即適宜的pH、溫度和一定的微生物作用，會(huì)

轉(zhuǎn)變成致癌物質(zhì)亞硝胺。

4.測(cè)定亞硝酸鹽含量的原理

(1)在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，與N-1一蔡基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合

形成玫瑰紅色染料。

(2)將顯色反應(yīng)后的樣品與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)顯色液耳測(cè)進(jìn)行比較,可以大致魚篁出泡菜中亞硝酸鹽的含

量。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

修整、洗滌、晾曬、切分成條狀或片

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三、泡菜腌制過程

1.泡菜壇的選擇

（1）應(yīng)選用火候好、無裂紋、無砂眼、壇沿深、蓋子吻合好的泡菜壇。

（2）檢查時(shí)可將壇口包上壓入水中，看壇內(nèi)有無蜀J現(xiàn)象。

2.腌制

（1）過程：

①將新鮮蔬菜預(yù)先處理成條狀或片狀。

②泡菜鹽水按清水和鹽為ILL質(zhì)量比配制煮沸冷卻備用。

③預(yù)處理的新鮮蔬菜裝至坐壇時(shí)放入蒜瓣、生姜、香辛料等佐料,

（如果希望發(fā)酵快些，可將蔬菜在開水中浸1分鐘后入壇，再加上一些白酒。）并繼續(xù)裝至八成滿。

④倒入配制好的鹽水，使鹽水沒過全部菜料。

⑤蓋上泡菜壇蓋子，并用水密封發(fā)酵。以保證壇內(nèi)為無氧環(huán)境。

發(fā)酵時(shí)間受到溫度影響。

注意：

①水封閉壇口起著使壇內(nèi)與壇外空氣隔絕的作用，空氣中21%是氧氣，這是最簡(jiǎn)易的造成無氧環(huán)境的方

法。這樣，壇內(nèi)可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵。如不封閉，則會(huì)有許多需氧菌生長(zhǎng)，

蔬菜會(huì)腐爛。

②泡菜發(fā)酵分為：

發(fā)酵前期：蔬菜剛?cè)雺瘯r(shí)，表面帶入的微生物，主要是以不抗酸的大腸桿菌和酵母菌等較為活躍，它們進(jìn)

行異型乳酸發(fā)酵和微弱的酒精發(fā)酵產(chǎn)生較多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以氣泡從水槽內(nèi)

放出，逐漸使壇內(nèi)形成嫌氣狀態(tài)。發(fā)酵產(chǎn)物中除乳酸外，還有其他，如乙醇、C02等稱異型乳酸發(fā)酵。

?泡菜壇內(nèi)有時(shí)會(huì)長(zhǎng)一層白膜，形成白膜是由于產(chǎn)膜酵母的繁殖。

?酵母菌是兼性厭氧微生物，泡菜發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)豐富，其表面氧氣含量也很豐富，適合酵母菌的繁殖。

發(fā)酵中期：由于前期乳酸的積累，pH下降，嫌氣狀態(tài)的形成，乳酸桿菌活躍進(jìn)行活躍的同型乳酸發(fā)酵，

乳酸積累pH達(dá)3.5~3.8.大腸桿菌、酵母菌、霉菌等的活動(dòng)受到抑制。這一期為完全成熟階段。發(fā)酵產(chǎn)

物中只有乳酸，稱為同型乳酸發(fā)酵。

發(fā)酵后期：繼續(xù)進(jìn)行乳酸發(fā)酵，乳酸積累達(dá)1.2%以上時(shí)，乳酸桿菌的活性受到抑制，發(fā)酵速度逐漸變緩

甚至停止。

腌制1周左右即可開壇食用。也可隨時(shí)加入新鮮蔬菜，不斷取用。如果加入一些已經(jīng)腌制過的泡菜汁更好，

這相當(dāng)于接種己經(jīng)擴(kuò)增的發(fā)酵菌，可減少腌制時(shí)間。?般在腌制10天后亞硝酸鹽含量開始降低，故在

10天之后食用最好。

四、亞硝酸鹽的測(cè)定

測(cè)定步驟

配制溶液一制備標(biāo)準(zhǔn)顯色液一制備樣品處理液一比色。

1.配制溶液：對(duì)氨基苯磺酸溶液N-1一蔡基乙二胺鹽酸鹽溶液亞硝酸鈉溶液

提取劑（氯化鎘、氯化領(lǐng)）：作用：增大亞硝酸鈉的溶解度

氫氧化鋁乳液（作用：作吸附劑，充分使濾液脫色）

2.5mol/l的氫氧化鈉溶液（中和過多鹽酸，營(yíng)造堿性環(huán)境）

2.制備標(biāo)準(zhǔn)顯色液

用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml>0.80ml、1.00ml、1.50ml亞硝酸鈉溶液，分別置于50ml比

色管中，再取1支比色管作為空白對(duì)照。并分別加入2.0ml對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3?5分鐘后，

再分別加入1.0mlN-1一蔡基乙二胺鹽酸鹽溶液，加蒸饋水至50ml,混勻，觀察亞硝酸鈉溶液顏色的梯度

變化。靜置N?L蔡基乙二胺鹽酸鹽

亞硝酸鈉溶液-----?對(duì)氨基苯磺酸溶液

3?5分鐘

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3.制備樣品處理液的步驟是

①稱取0.4kg泡菜，粉碎榨汁，過濾得約200mL汁液。

②取100mL汁液倒入500mL容量瓶，添加200mL蒸山水和100mL提取劑,搖床振蕩lh,再加40mL氫

氧化鈉溶液，最后用蒸儲(chǔ)水定容到500mL并立刻過港獲得漉液。

③將濾液60mL移入100mL容量瓶，用氫氧化鋁乳液（吸附脫色）定容后過濾，獲得無色透明的濾液。

的市bf地計(jì)一?y臺(tái)______＞汁液.MzK_加氫氧化鈉定卷

取泡菜榨汁過濾+

4.比色：生氧化鋁乳液定容

①將40mL濾液移入50mL比色管中，并編號(hào)。

②分別依次加入2.0mL的對(duì)氨基苯磺酸溶液和1.0mL的NT-蔡基乙二胺鹽酸溶液，并定容到50mL,混

勻靜置15mino

③觀察顏色變化，并與標(biāo)準(zhǔn)顯色液比較,記錄亞硝酸鹽含量。

亞（1）亞硝酸鹽含量在第旦天達(dá)到最高峰。

硝

（2）亞硝酸鹽含量升高的原因是由于泡菜在開始腌制時(shí)，壇內(nèi)環(huán)境有利于某些

酸

細(xì)菌的繁殖（包括一些硝酸鹽還原菌），這些細(xì)菌可以促進(jìn)硝酸鹽還原為亞硝

鹽

酸鹽。

含

（3）亞硝酸鹽含量降低的原因：隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸細(xì)菌也大量

量

繁殖，對(duì)硝酸鹽還原菌產(chǎn)生一定的抑制作用，使其生長(zhǎng)繁殖受到

一影響，同時(shí)形成的亞硝酸鹽又被分解，造成泡菜中亞硝酸

發(fā)酵時(shí)間（d）鹽的含量又有所下降。

④計(jì)算樣品濾液（40mL）中亞硝酸鹽含量。

計(jì)算公式是:樣品中亞硝酸鹽含量（mg）

取樣量（40mL濾液的質(zhì)量，Kg）

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專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

一、基礎(chǔ)知識(shí)

1.培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，是進(jìn)行微生物培養(yǎng)的

物質(zhì)基礎(chǔ)。

（1）培養(yǎng)基分類

①按照物理性質(zhì)可分為

液體培養(yǎng)基:應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn)

半固體培養(yǎng)基:主要用于鑒定微生物運(yùn)動(dòng)力

固體培養(yǎng)基:應(yīng)用于微生物的分離、計(jì)數(shù)和鑒定

注意：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂（是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑）后，

制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，可.以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判

斷是哪一種菌。

②按照成分培養(yǎng)基可分為

人工合成培養(yǎng)基:用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微生物的

分離鑒定

天然培養(yǎng)基:是用化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成，常用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)。

③按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為

選擇培養(yǎng)基:是指在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微

生物的生長(zhǎng)。（如：加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌）

■加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基--------------分離金黃色葡萄球菌

?不加氮源的無氮培養(yǎng)基-----------------分離固氮菌

?不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基----------分離自養(yǎng)型微生物

?加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基-----------分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞

鑒定培養(yǎng)基:是根據(jù)微生物的特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒

別不同類別的微生物.（伊紅和美藍(lán)培養(yǎng)基可鑒別大腸桿菌）

（2）培養(yǎng)基的化學(xué)成分一般都含有水、無機(jī)鹽、碳源、氮源、四類營(yíng)養(yǎng)成分。

?碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如C（h、NallC03等無機(jī)碳源：糖類（最常用的碳源，尤其

是葡萄糖）、石油、花生粉餅等有機(jī)碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

?氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如林NibsNO3、NH；（無機(jī)氮源）蛋白質(zhì)、氨基酸、尿

素、牛肉膏、蛋白腺（有機(jī)氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2c氮源主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸以及

有的碳源只能是碳源;如C02有的碳源可同時(shí)是氮源。如NH,HCCh有的碳源可同時(shí)是能源，如葡萄糖

有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白陳

含氮的代謝產(chǎn)物.

?在提供上述幾種主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)PH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（生長(zhǎng)因子）

以及氧氣等的要求。例如：培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加維生素；培養(yǎng)霉菌時(shí)需要將培養(yǎng)基的PH

調(diào)至酸性：培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)需要將培養(yǎng)基的PH調(diào)至中性或微堿性:培養(yǎng)氏氧微生物時(shí)需要提供無氧的條件。

2.無菌技術(shù)

（1）獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵。避免雜菌污染的方法主要包括以下四個(gè)內(nèi)容：

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①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。

②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。

③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。

④實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？

答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。

消毒是指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部?部分對(duì)人體為害的微牛.物（不包括芽

抱和抱子）“

滅菌是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽抱和抱了。

?消毒和滅菌的比較

比較項(xiàng)理化因素的作用強(qiáng)度消滅微生物的數(shù)量芽泡和抱子能否被消滅

消毒較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能

滅菌強(qiáng)烈全部微生物能

（2）實(shí)驗(yàn)室常用的消毒方法是煮沸消毒法，巴氏消毒法（對(duì)于一些不耐高溫的液體）,此外，人們也常

使用化學(xué)藥劑進(jìn)行消毒，如用酒精、氯氣、等。常用的滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅

菌.

,此外，實(shí)驗(yàn)室里還用紫外線或化學(xué)藥物（石碳酸或煤酚七）進(jìn)行消毒。

滅菌方法：

①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；

②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱：

③培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋O

④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

注意：無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還能有效避免操作者自身被微

生物感染。

二、實(shí)驗(yàn)操作

1.制備牛肉膏蛋白陳固體培養(yǎng)基

（1）制備牛肉膏蛋白陳固體培養(yǎng)基的方法步驟：

計(jì)算一稱量f溶化f滅菌f倒平板

注意：培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50C左右時(shí)，才能用來倒平板?？梢杂檬钟|摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，

感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。

（2）倒平板的過程

①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

②右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過火焰。（通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。）

③用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約10?20mL）

倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

④等待平板冷卻凝固，大約需5?lOmin。然后，將平板倒過來放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。

（平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培

養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。）

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注意：①在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板就不能用來培

養(yǎng)微生物了。國(guó)為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)

微生物。

②如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1~2天后無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則

需要重新制備。

2.純化大腸桿菌

（1）微生物接種的方法中最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法，

平板劃線法是指通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表而連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基

的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由…個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的了細(xì)胞群體，這就是菌落C

稀釋涂布平板法是指將菌液進(jìn)行,系列的梯度稀釋，然*將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基

的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

注意—用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在

培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落，以便于純化菌種。

（2）平板劃線的操作步驟如下：

①將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞.，

③將試管口通過火焰。④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。

⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞，⑥左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平

板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)皿。⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后（以免接種環(huán)溫

度太高，殺死菌種。）,從第一區(qū)域劃線的末端開始往第?.區(qū)域內(nèi)劃線。再復(fù)以上操作，在二四、五

區(qū)域內(nèi)劃線.注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為r避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物：每次劃線前灼燒接種

環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次

劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后

灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

（2）系列稀釋操作步驟：

至薛鋒探作

I.將分別潞仃

9mL水的6支狀管滅

苗.并按W~1①的

順J評(píng)

2.用移液管吸

511mUft也幽掰版.

讓入第一支試注中“

用手指鉆匕核滋行上.的枕皮炙.吹吸?:次.蝕曲液與水充分混勻.

3.從I。倍林樣的試管中吸取ImL恬樣液.注入1CF儕稱祁的試管中.近狂舉2小的操作.儂

次類推.仃列完成段后支試骨的耨科.

注京，核濃TV；方要經(jīng)過火陸.探作M.試忤口用邛析儀恰應(yīng)作離火燼1~2cm處.

?

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涂布平板操作步驟:

①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基我面。

③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8?10s。

④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。

注意：涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。如第2步進(jìn)行無菌操作。應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無

菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；

等等。

3.菌種的保存

（1）對(duì)于頻繁使用的菌種，可以采用臨時(shí)保藏的方法。

①臨時(shí)保藏方法

將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長(zhǎng)成后，將試管放入4'C的冰

箱中保藏.以后每3?6個(gè)月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。

②缺點(diǎn)：這種方法保存的時(shí)間不長(zhǎng)，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。

（2）對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，

放在一20c的冷凍箱中保存。

附：生物的營(yíng)養(yǎng)

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是指維持機(jī)體生命活動(dòng)，保證發(fā)育、生殖所需的外源物質(zhì)。

在人及動(dòng)物，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括水、無機(jī)鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類；在植物，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括

礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類：在微生物，則有水、無機(jī)鹽、碳源、氮源及特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)五類。

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課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

一、實(shí)驗(yàn)原理

1.尿素是由碳、氮、氧和氫組成的有機(jī)化合物。外觀是白色晶體或粉末。一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并

不能直接被農(nóng)作物吸收。只有被土壤中的細(xì)菌將尿素分解成第之后,才能被植物吸收利用。土壤中的細(xì)菌

之所以能分解尿素，是因?yàn)樗麄兡芎铣上倜?尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的.

2.實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選應(yīng)用的原理是：

人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件（包括常養(yǎng)、溫度、川等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。

3.選擇培養(yǎng)基是指在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)

的培養(yǎng)族。目的是從眾多微生物中分離所需要的微生物。

■配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)

根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點(diǎn)加入某種物質(zhì)以達(dá)到選擇的目的。

例如，

培養(yǎng)基中不加入有機(jī)物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；

培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物，因?yàn)榉枪痰⑸锊荒茉诖伺囵B(yǎng)基上生存。

石油是唯一碳源時(shí)，可以抑制不能利用石油的微生物的生長(zhǎng)，使能夠利用石油的微生物生存，達(dá)到分離能

消除石油污染的微生物的目的。

加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。

加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。

加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。這里的加入是在培養(yǎng)的培養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上加入的。

將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物。

4對(duì)分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定

①原理：細(xì)菌分解尿素時(shí)產(chǎn)生氨，氨使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)。因此，可通過檢測(cè)培養(yǎng)基PH變化來鑒定該種

細(xì)菌能否分解尿素

②方法：在選擇培養(yǎng)基中加酚紅指示劑，培養(yǎng)細(xì)菌，觀察指示劑是否變紅。菌落周圍出現(xiàn)紅色圓環(huán)

5.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目

常用來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌數(shù)目的方法是稀釋涂布平板法。

另外，顯微鏡直接計(jì)數(shù)也是測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法

二實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

三.實(shí)驗(yàn)的具體操作流程

（1）土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。在富含有機(jī)質(zhì)的土壤表

層，有更多的微生物生長(zhǎng)。從富含有機(jī)物、潮濕、pHk7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3?8cm

的土壤層取樣。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。應(yīng)在火焰旁稱取土壤，在火焰附

近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。

（2）樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目。在實(shí)際操作中，通常選用一定稀

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釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間、適于計(jì)數(shù)的平板。

測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用104105I06

測(cè)定放線菌的數(shù)量，一般選用1031Q4105

測(cè)定真菌的數(shù)量，一般選用102103104

（3）微生物的培養(yǎng)與觀察

不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌30~37℃1~2天

放線菌25~28℃5~7天霉菌25~28℃3~4天

每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而

導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目,一般來說,在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、唯獨(dú)及培養(yǎng)時(shí)間），同種微生物

表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色

?設(shè)置對(duì)照

設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)是

指除了被測(cè)試的條件以外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)，其作用是比照試驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾，

證明確實(shí)是所測(cè)試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。

（4）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目

①常用來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌數(shù)目的方法是稀釋涂布平板法。

②理論依據(jù)：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。

通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在

3?5的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)

一般來說，選擇菌落數(shù)在30?300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值。統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。

這是因?yàn)閮蓚€(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不

是活菌數(shù)來表示。計(jì)算出平板菌落數(shù)平均值，然后按公式進(jìn)行計(jì)算。

每克樣品中的菌落數(shù)=（C/V）*M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板

時(shí)所用的稀釋液的體積（ml）,M代表稀釋倍數(shù)

采用此方法的注意事項(xiàng)：1.為了防止菌落蔓延，影響計(jì)數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入TTC

2.本法僅限于形成菌落的微生物。

另外，顯微鏡直接計(jì)數(shù)也是測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法（不能區(qū)分死菌與活菌不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)

需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察）

計(jì)算公式

每亳升原液所含細(xì)菌數(shù)=每小格平均細(xì)菌數(shù)X400X10000X稀釋倍數(shù)

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課題3分解纖維素的微生物的分離

基礎(chǔ)知識(shí)：

（一）纖維素和纖維素酶

1、纖維素

纖維素是一種由姬健首尾相連而成的高分子化合物。植物每年產(chǎn)生的纖維素能被土壤中的某些微生

物分解利用，是因?yàn)樗鼈兡墚a(chǎn)生紅維素也。對(duì)這些微生物的研究與利用，使人們能夠利用秸稈等廢棄物生

產(chǎn)酒精,用纖維素酶處理服裝面料等。

①作用：纖維素在造紙業(yè)中大量使用，是重要的造紙?jiān)稀?/p>

纖維素可以制成甲基纖維素、乙基纖維素、較甲基纖維素、微晶纖維素等衍生物。

食物中的纖維素（即膳食纖維）對(duì)人體的健康也有著重要的作用。

②分布：纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一類多糖,植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖

維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。木材、作物秸稈等也富含纖維素。

注意：

纖維素與淀粉都是由葡萄糖組成的，但組成兩者的葡萄糖的連接方式不同，因而使兩者的形態(tài)完全不同。

2、纖維素酶的組成及作用

纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即口肝、Cx酶和葡萄糖合院,前兩種酶使纖

維素分解成纖維二糖,第三種酶將紅維三超分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長(zhǎng)

提供營(yíng)養(yǎng)。

（-）纖維素分解菌的篩選

1、纖維素分解菌的篩選方法：剛果紅染色'法,這種方法能夠通過顏色反應(yīng)直接對(duì)微生物進(jìn)行篩選。

2、纖維素分解菌的篩選方法的原理

剛果紅是一種染料，它可以與纖維素形成紅色復(fù)合物,但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種

反應(yīng)。當(dāng)我們?cè)诤欣w維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)

纖維素被纖維素酶分解后剛果紅一纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的

透明圈。這樣我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

三、實(shí)驗(yàn)操作

分離分解纖維素的微生物實(shí)驗(yàn)流程：

土壤取樣一選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中H的菌株數(shù)量的多少來確定）-梯度稀釋將樣品涂

布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上一挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。

（-）土壤取樣

采集土樣時(shí)，由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相

對(duì)提高，因此從這種上樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。如樹林中多年落葉形成的腐殖上，多

年積累的枯枝敗葉等等。若找不到合適環(huán)境，可將濾紙埋在土壤中一個(gè)月左右（濾紙埋在土壤中能使纖維

素分解菌相對(duì)聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右腐

殖土壤中。），也會(huì)有能分解纖維素的微生物生長(zhǎng)。

（二）選擇培養(yǎng)

1.選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度,以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。

2.制備選擇培養(yǎng)基：

①旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？

是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑。

②這個(gè)培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？

有選擇作用，本配方中的碳源是纖維素，所以能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。

③你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基的作用

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用牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基與之對(duì)照。

3、選擇培養(yǎng)

將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1?2

天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)

注意：為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？

在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)

條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。

（三）梯度稀釋

將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋IO,?10“倍。將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上。

（四）將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上

1.制備培養(yǎng)基:參照課本旁欄中的比例配制。

2.倒平板操作。

3.涂布平板：將稀釋度為IO,?KT的菌懸液各取o.iml涂布到平板培養(yǎng)基上，30c倒置培養(yǎng)，菌落周圍會(huì)

出現(xiàn)明顯的透明圈。

4.挑選產(chǎn)生透明圈的菌落（參照課本剛果紅染色法，挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。）

（五）剛果紅染色法

方法一：先培養(yǎng)微生物,再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。

優(yōu)點(diǎn)：這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。

缺點(diǎn)：操作繁瑣，加入剛果紅溶液時(shí)會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜。

方法二：在倒平?板時(shí)就加入剛果紅。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，不存在菌落混雜問題。

缺點(diǎn)1：由于在纖維素粉和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出

現(xiàn)假陽性反應(yīng)。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中纖維

素占主要地位，因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分

缺點(diǎn)2：有些微生物具有降解色素的能力，他們?cè)陂L(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中會(huì)降解剛果紅而形成明顯的透

明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。

對(duì)分解纖維素的微生物進(jìn)行了初步的篩選后，只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，

還需要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測(cè)定方

法，一般是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量的測(cè)定。

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專題3植物的組織培養(yǎng)技術(shù)

課題1菊花的組織培養(yǎng)

一、基礎(chǔ)知識(shí)

1.細(xì)胞分化

概念：植物的個(gè)體發(fā)育過程中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和牛.理功能上都會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定性的差異,形成這些差

異的過程就叫做細(xì)胞分化。細(xì)胞分化是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果。

?細(xì)胞分化是一種持久性的變化，它有什么生理意義？

使多細(xì)胞生物體中細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能趨向?qū)ｉT化，有利于提高各種生理功能的效率。

2.細(xì)胞全能性

已經(jīng)分化的細(xì)胞。所具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能,即每個(gè)生物細(xì)胞都具有全能性,因?yàn)楹腥走z

傳信息.（細(xì)胞全能性是組織培養(yǎng)的基本原理）。但在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育過程中并不表現(xiàn)出來，這是因?yàn)樵?/p>

特定的時(shí)間和空間條件下,通過基因的選揖蛭達(dá)，構(gòu)成不同組織和器官。

3、植物組織培養(yǎng)

離體的植物組織或細(xì)胞（又叫外植體）,在培養(yǎng)了一段時(shí)間以后，會(huì)通過細(xì)胞分裂，形成愈傷組織，

愈傷組織的細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。由高度分化的植物組

織或細(xì)胞產(chǎn)生遂傷組織的過程,稱為植物細(xì)胞的脫分化，或者叫做去分化。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)

行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官,這個(gè)過程叫做再分化。再分化形成的試管苗，移栽到地里，可

以發(fā)育成完整的植物體。

植物組織培養(yǎng)的基本過程

人為使用植物激素控制

注意：①脫分化：指已經(jīng)分化的植物器官、組織或細(xì)胞,當(dāng)受到創(chuàng)傷或進(jìn)行離體（也受到創(chuàng)傷）培養(yǎng)時(shí)，

已停止分裂的細(xì)胞,又重新恢復(fù)分裂,細(xì)胞改變?cè)械姆只癄顟B(tài),失去原有結(jié)構(gòu)和功能,成為具有未分化特

性的細(xì)胞。

②植物組織培養(yǎng)必要條件：細(xì)胞離體;一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件。

?影響植物組織培養(yǎng)的因素

1.內(nèi)部因素：植物材料的選擇直接關(guān)系到試驗(yàn)的成敗。

植物的種類、材料的年齡和保存時(shí)間的長(zhǎng)短等都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度差別很大。

煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易。枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難C

同種植物材料，年齡、保存時(shí)間的長(zhǎng)短等也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

菊花的組織培養(yǎng)，一般選擇砧花擅物的莖上部新萌生的側(cè)枝。

一般來說，容易進(jìn)行無性繁殖的植物容易進(jìn)行組織培養(yǎng)。

選取生長(zhǎng)旺盛嫩枝進(jìn)行組培的是嫩枝生理狀態(tài)好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。

2.外部因素：

（1）營(yíng)養(yǎng)條件：離體的植物組織和細(xì)胞，對(duì)營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對(duì)特殊，需要配制適宜的培養(yǎng)基。

常用的是還培養(yǎng)基，其主要成分包括：大量元素,如N、P、S、K、Ca、Mg；微量元素,如Fe、Mn、

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B、Zn、Cu、Mo、I、C。：有機(jī)物有甘氨酸、煙酸、肌聘、維生素、蔗糖等。

(2)植物激素：植物激素中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性因素。在生

長(zhǎng)素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)趨勢(shì)。在培養(yǎng)基中需要添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等植物激

素，其濃度、使用的先后順序、用量的比例等都影響結(jié)果。

生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比值與結(jié)果

使用順序?qū)嶒?yàn)結(jié)果

比值高時(shí)促根分化，抑芽形成

先生長(zhǎng)素，

有利于分裂但不分化比值低時(shí)促芽分化，抑根形成

后細(xì)胞分裂素

比值適中促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)

先細(xì)胞分裂素，

細(xì)胞既分裂也分化

后生長(zhǎng)素

同時(shí)使用分化頻率提高

(3)環(huán)境因素：PII、溫度、光等條件也能影響植物組織培養(yǎng)。不同的植物對(duì)各種條件的要求往往不同。

菊花組織培養(yǎng)，一般PH控制在鷗左右j溫度控制在坨絲2；每天用日光燈照射12小時(shí)。

三、實(shí)驗(yàn)操作過程

1.制備MS固體培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)室一般使用4c保存的配制好的培養(yǎng)基母液來制備

(1)配制各種母液。

配制母液時(shí)，大量元素濃縮10倍,微量元素濃縮100倍