飼料中鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉的測定 編制說明

《飼料中鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉的測定》編制說明（定向征求意見稿）一、工作簡況 1（一）任務來源 1（二）標準制定背景 1（三）工作過程 4二、標準編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù) 4（一）標準編制原則 4（二）標準主要技術(shù)內(nèi)容的確定 51標準方法的目的 52高效液相色譜法的建立 62.1液相色譜條件 62.2提取條件的確定 2.3凈化方法的確定 2.4標準溶液的穩(wěn)定性 2.5方法性能考察 3液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的建立 283.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件 283.2提取凈化方法的確定 333.3標準溶液的穩(wěn)定性 333.4基質(zhì)效應的考察 343.5方法性能考察 37三、試驗驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟論證，預期的經(jīng)濟效果 47四、與國際、國外同類標準技術(shù)內(nèi)容的對比情況，或者與測試的國外樣品、樣機的有關(guān)數(shù)據(jù)對比情況 48五、采標情況，以及是否合規(guī)引用或采用國際國外標準 48六、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性標準的關(guān)系 48七、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù) 48八、涉及專利的有關(guān)說明 48九、貫徹國家標準的要求，以及組織措施、技術(shù)措施、過渡期和實施日期的建議等措施建議 48十、其他應予說明的事項 48參考文獻 49120203888-T-469。起草單位之一的中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技管總局規(guī)定，國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（北京）更名為國家飼料質(zhì)量檢陜西省農(nóng)業(yè)檢驗檢測中心和陜西中禾農(nóng)檢分析檢測有限公司等4家單位組起，鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉及其制劑就在飼料中普遍添加使用，以期達到預防或治療的作用。我國農(nóng)業(yè)部168號公告飼料添加劑使用規(guī)范中曾就這些抗球蟲劑的使用方法、添加劑量、休藥期和使用中應注意的事項給出了具體規(guī)定。然而，隨著人們對細菌耐藥性和食品中抗生素等獸藥殘留問題的認識，世界各國不斷通過法律法規(guī)發(fā)起了“禁246號公告，廢止了僅有促生長用途的藥物飼料添加劑，給出了抗球蟲和中藥類飼料添加劑的質(zhì)量標準和使用方法。針對鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯2鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯250g/kg、雞、對羔羊、犢牛球蟲病也有效混飼，500g/t8g/t產(chǎn)蛋期禁用鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯、磺胺喹噁啉200g/kg、120g/kg雞、火雞。對家兔、球蟲病也有效混飼，500g/t60g/t產(chǎn)蛋期禁用注：摘自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部246號公告附件3。為配合相關(guān)法律法規(guī)、確?？骨蛳x劑的質(zhì)量和藥效，國內(nèi)外曾出臺一系列的飼料中藥物的檢測方法，如美國AOAC給出了飼料中氨丙啉測定的分光光度法（AOACOfficialMethod961.24）和熒光分光光度法（AOACOfficialMethod964.29）和飼料中磺胺喹噁啉測定的分光光度法（AOAC氧酰胺苯甲酯測定的分光光度法（見74/203/EEC），后來又發(fā)布了飼料中氨丙啉測定的液相色譜法（見1999/27/EC）。我國先后發(fā)布了GB/T8381.11-2005《飼料中鹽酸氨丙啉的測定高效液相色譜法》、GB/T8381.10-2005《飼料中磺胺喹噁啉的測定高效液相色譜法》、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部此外在多個磺胺類藥物測定方法的目標化合物中都涵蓋了磺胺喹噁啉（見3GB/T8381.11-2005飼料中鹽酸氨丙啉的測定高效液相色譜法GB/T8381.10-2005飼料中磺胺喹噁啉的測定高效液相色譜由于飼料中鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉檢測方法標準都法，所以急需建立一個能同時對這3種藥物進行檢測高效液相色譜法和液廣總站、陜西省農(nóng)業(yè)檢驗檢測中心和陜西中禾農(nóng)檢分析檢測有限公司等組4定標準溶液的保質(zhì)期；考察不同提取溶液、提取次數(shù)的提取效果，確定方方法性能，包括方法線性范圍、準確度、精確度、檢出限和定量限等，形本標準修訂依據(jù)國家標準GB/T1.1-25對獸藥在允許使用領域的合理使用和不允許使用領域的非法使用的監(jiān)測要本次國家標準修訂目標是將單一抗球蟲藥物的液相色譜法修改為鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉的同時測定的高效液相色譜法和液），有關(guān)鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉化學結(jié)構(gòu)、理化特性是在方法研究建立中必須考慮和應用的基礎信息，如根據(jù)這些化合物的結(jié)構(gòu)特點，充分利用其共性或相似之處，得到好的提取凈化效果，利用其差異在同時測定中，實現(xiàn)好的分離和靈敏的檢測。鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯6化合物名稱鹽酸氨丙啉乙氧酰胺苯甲酯磺胺喹噁啉英文名稱AmproliumHydrochlorideEthopabateSulfaquinoxaline分子式C12H15NO4C14H12N4O2S分子量315.24237.25300.34CAS號137-88-259-06-359-40-5溶解性易溶于水、甲醇和乙醇，稍溶于乙醚，不溶于氯仿溶于乙醇、乙醚、丙二醇和精油，微溶于水微溶于水、甲醇、DMSO，溶于堿溶液用高效液相色譜儀對3種藥物混合標準溶液進行了測定，見圖2。從圖2于目標物與雜質(zhì)的分離；之后采用極性HILIC柱用超高效液相色譜儀對3~4min，同樣不利于目標物與雜質(zhì)的分離，所以未被采用。以上試~表明：對于極性差異大的3種化合物，簡單采用非極性或極性色譜柱都無法達到良好保留和分離效果。在參考相關(guān)文獻基礎上，試驗選擇含有離子對試劑的流動相，利用氨丙啉和離子對試劑的相互作用，改變氨丙啉在非極性色譜柱上的保留性質(zhì)，使氨丙啉在非極性色譜柱上的有較好保留，實乙氧酰胺苯甲酯鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉 乙氧酰胺苯甲酯 乙氧酰胺苯甲酯磺胺喹噁啉乙氧酰胺苯甲酯鹽酸氨丙啉在確定使用含離子對試劑的流動相后，對離子對試劑進行了篩選。經(jīng)用十二烷基磺酸鈉。雖然庚烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉常用的離子對試劑，但十二烷基磺酸鈉保留過強，庚烷磺酸鈉保留能力適中，所以最終采用庚烷磺酸鈉作為離子對試劑。流動相組成參考中國獸藥），鹽酸氨丙啉鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉乙氧酰胺苯甲酯3種藥物均具有紫外吸收特性，在飼料和畜產(chǎn)品中測定方法標準或文////////《中國獸藥典》（2020版）中鹽酸氨丙啉/////《中國獸藥典》（2020版）中鹽酸氨丙啉//《中國獸藥典》（2020版）中乙氧酰胺苯//////1//23//4根據(jù)紫外掃描結(jié)果和有關(guān)參考文獻，使用高效液相色譜儀比較了246差異，但差距不大，264nm、267nm和270nm下響應基本一致，246nm稍低。在后續(xù)考察配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和預混合飼料空白料數(shù)量級以上，在紫外檢測器上響應值明顯低于其他2種化合物。為保證3種不同含量藥物同步檢測精密度和準確度一致性，試驗利用乙氧酰胺苯甲酯的熒光特性，在紫外檢測器后串聯(lián)熒光檢測器方式，前者用于鹽酸氨丙啉和磺胺喹噁啉的測定，后者用于乙氧酰胺苯甲酯的測定。在已確定的色譜條件下，鹽酸氨丙啉和磺胺喹噁啉先出峰，乙氧酰胺苯甲酯最后出峰，鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉乙氧酰胺苯甲酯啉查閱相關(guān)標準及文獻，飼料中3種藥物大多數(shù)采用甲醇和水混合溶液丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉提取效率醇+水=2+1溶液和甲醇+水=4+1溶液對磺胺喹噁啉的提取效率差不多，綜比較了1次提取和2次提取的效果，結(jié)果表明鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲高，所以本標準采用甲醇+水=4+1溶液作為提取溶液，并采用2次超聲的對于三種化合物提取液的凈化，早期文獻中多采用極性固相萃取柱進行凈化，如采用中性氧化鋁柱去除極性雜質(zhì)。隨著固相萃取柱的發(fā)展，出現(xiàn)了許多不同極性的固相萃取柱，所以近年來的文獻中多采用非極性固相采用Waters公司和大連沈源檢驗檢測化，分別用80%甲醇和純甲醇進行洗脫，回收率試驗結(jié)果見表8。從表8可以看出，3種化合物經(jīng)PRiMEHLB柱凈化后，回收率在收率能達檢測方法要求，但磺胺喹噁啉添加回收率低，達不到檢測方法要求，所以本標準采用HLB柱凈化，不采用WCX柱和中性氧化鋁柱凈化。酯所以采用pH8.5的磷酸緩沖溶液作為上柱溶液。30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲淋洗液上柱回收率（%）鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉乙氧酰胺苯甲酯10%甲醇0.00.00.020%甲醇3.96.70.030%甲醇4.50.040%甲醇22.40.050%甲醇39.858.60.060%甲醇52.774.653.570%甲醇74.184.882.880%甲醇81.289.290%甲醇86.493.490.694.399.792.0采用一定比例的庚烷磺酸鈉溶液和甲醇混合溶液作為液相色譜測定前待測物名稱待測物質(zhì)量（mg）溶解效果（回收率）庚烷磺酸鈉溶液+庚烷磺酸鈉溶液+鹽酸氨丙啉2099.35099.0磺胺喹噁啉49.63037.099.06025.899.2乙氧酰胺苯甲酯197.62.594.999.4598.0鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉乙氧酰胺苯甲酯上柱量（mg）上柱量（mg）回收率（%）上柱量（mg）回收率（%）2098.415086.23088.52.593.496.36096.4590.29098.07.59920078.194.094.840057.424097.32060043.036089.230400mg、600mg上柱量回收率低于80%；磺胺mg~360mg時回收率大于88%，乙氧酰胺苯甲酯柱上柱量在1mg~30mg鹽酸氨丙啉標準儲備溶液500μg/mL、乙氧酰胺苯甲酯標準儲備溶液500μg/mL和磺胺喹噁啉標準儲備溶液500μg/mL，配制分從表14看出，鹽酸氨丙啉和乙氧酰胺苯甲酯標準儲備溶液第2次~第期為6個月。100μg/mL，配制分裝后存于-18℃以下冰箱中保存。配制當天為0天，在標準中間溶液用流動相稀釋后，以測定當日新配制的3種藥物標準溶液測高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的標準儲備溶液和標準中間配制混合標準系列溶液，在確定后的液相色譜條件下進行測定，考察12536鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉乙氧酰胺苯甲酯高效液相色譜方法主要用于對允許使用此3種藥物的測定，考察方法準確度和精密度的添加回收試驗，配合飼料中添加濃度以246號公告中規(guī)4種飼料基質(zhì)的添加回收試驗結(jié)果見表17~表20，空白樣品和添加樣目標物回收率(%)(%)(%)(%)鹽酸氨丙啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ乙氧酰胺苯甲酯ⅠⅡⅢ5ⅠⅡⅢⅠⅡⅢ磺胺喹噁啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ目標物回收率(%)(%)(%)(%)鹽酸氨丙啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ乙氧酰胺苯甲酯ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ磺胺喹噁啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ目標物回收率(%)(%)(%)(%)鹽酸氨丙啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ乙氧酰胺苯甲酯ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ磺胺喹噁啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ目標物回收率(%)(%)(%)(%)鹽酸氨丙啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ乙氧酰胺苯甲酯ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ磺胺喹噁啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ磺胺喹噁啉鹽酸氨丙啉鹽酸氨丙啉乙氧酰胺苯甲酯磺胺喹噁啉鹽酸氨丙啉乙氧酰胺苯甲酯鹽酸氨丙啉鹽酸氨丙啉噁啉磺胺喹乙氧酰胺苯甲酯磺胺喹噁啉磺鹽酸氨丙啉乙氧酰胺苯甲酯在4種空白基質(zhì)中添加一定量的鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉標準品，樣品經(jīng)前處理后，用HPLC進行測定，當檢測樣品中色譜峰的信噪比大于等于3時，添加鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺啉的濃度即為檢出限，試樣中氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉的峰的濃度即為定量限。該鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉高效液目標物回收率(%)(%)(%)鹽酸氨丙啉5料料乙氧酰胺苯甲酯料料磺胺喹噁啉3料料離子的m/z243.3，通過子離子掃描得標準牛可食性組織中氨丙啉殘留量的測定液相色譜21316-2007《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定液相），時，雖然基質(zhì)效應減弱，但乙氧酰胺苯甲酯和磺胺圖見圖20）時，既能克服0.1%甲酸溶液-甲醇對鹽酸氨丙啉的影響，又能確保乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉色譜峰的分028955鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉乙氧酰胺苯甲酯（0.1%甲酸溶液-甲醇流動相）0235456鹽酸氨丙啉磺胺喹噁啉乙氧酰胺苯甲酯（0.1%甲酸溶液-乙腈流動相）上機溶液濃度超出曲線范圍需要重新處理試樣上機溶液濃度時使用，這樣做可避免從提取或凈化步驟重新處理試樣溶液和基質(zhì)空白溶液，節(jié)省了工鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁啉混合標準中間溶液，濃度測標準中間溶液用流動相稀釋后，以測定當日新配制的3種藥物標準溶液從表25可以看出，3種藥物標準中間溶液，第2次~第6次測定值與由于不同種類飼料樣品組成不同，且成分復品（包括蛋雞配合飼料、雞濃縮飼料、奶牛精料補充料和雞預混合飼料）的空白樣品，按4.5.1和4.5.2處理，得到基質(zhì)空白溶液。分別準確合標準系列溶液分別測定，得到4組曲線的回歸方程，用基質(zhì)匹配標準曲和磺胺喹噁啉三種化合物時的基質(zhì)效應進行考察，結(jié)果見圖21和表26。乙氧酰胺苯甲酯基質(zhì)效應次之，磺胺喹噁啉基質(zhì)效應最弱?？紤]到樣品基質(zhì)對定量結(jié)果的影響和定量方法的通用性，本標準確定用基質(zhì)匹配標準曲啉料YYYYYY酯YY料YYYYYYY啉Y料YYYYYY在上述優(yōu)化條件下，試驗選取蛋雞配合飼料、雞濃縮飼料、奶牛精料補充料和雞預混合飼料空白樣品，按4.5.1和4.5.2處理待測物鹽酸氨丙啉11112222b值b值b值b值rrrr乙氧酰胺苯甲酯11112222b值b值b值b值rrrr磺胺喹噁啉11112222b值b值b值b值rrrr在空白基質(zhì)中添加一定量的鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹噁中色譜峰的信噪比大于等于3時，添加鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺喹噁啉的濃度即為檢出限，試樣中鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺磺胺喹噁啉的濃度即為定量限。該鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯和磺胺喹液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法主要用于對不允許使用此類藥物的飼料產(chǎn)品的目標物測定批回收率(%)(%)(%)(%)鹽酸氨丙啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ乙氧酰胺苯ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ磺胺喹噁啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ目標物測定批回收率(%)(%)(%)(%)鹽酸氨丙啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ乙氧酰ⅠⅡ胺苯甲酯ⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ磺胺喹噁啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ目標物測定批回收率(%)(%)(%)(%)鹽酸氨丙啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ乙氧酰胺苯甲酯ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ磺胺喹噁啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ目標物測定批回收率(%)(%)(%)(%)鹽酸氨丙啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ乙氧酰胺苯甲酯ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ磺胺喹噁啉ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ國標修訂版修改完善了GB/T8381.11-2005飼料中鹽酸氨丙啉的測定種增加到3種，補充了液相色譜法的凈化步驟，更改了檢出限和定量限，在標準的制訂過程中嚴格貫徹國家有關(guān)方針、政策、法律和規(guī)章等，嚴格執(zhí)行強制性國家標準和行業(yè)標準。與相關(guān)的各種基礎標準相銜接，遵4.GB/T8381.10-2005飼料中磺胺喹噁啉的測定高12.GB31613.1-2021食品安全國家標準牛13.GB31660.9-2019法）：）：）：23.邵德佳，劉佩玉.紫外分光光度法測定鹽酸氨丙啉、乙氧酰胺苯甲酯）：），）：）：29.CommissionDirective74/203/EEC,establishingCommunitymethodsofanalysisfortheofficialcontroloffeedingstuffs30.CommissionDirective1999/27/EC,establishingCommunitydeterminationofamprolium,diclazurilandcarbadoxinfeedingstuffsandameDirectioves71/250/EEC,73/46/EECandrepealingDirective74/231.DavidW，F(xiàn)ink.FurtherStudiesontheSpeAmprolium[J],JournalofAOACInternational,2004,87(3):677-68032.KeithD.Gallocano,HyunPark,JohnYee.SimultaneousLiquidChrScreeningofFiveCoccidiostats