回族非綜合征型聾病基因流行病學(xué)研究

第第頁回族非綜合征型聾病基因流行病學(xué)研究一、資料與方法

1.臨床資料

420例回族NSHL患者來自中國西北地區(qū),包括寧夏、甘肅、青海、陜西和新疆五個(gè)省份部分地區(qū)特殊教育學(xué)校的306名聾啞學(xué)生和甘肅省回族聚集地的114例散發(fā)病例。420例患者均為來自不同家庭的耳聾先證者,無耳聾家系患者,其中先天性聾377例,語后聾43例;男233例,女187例,男女比例為1.26:1,年齡1～73歲(平均19.25±4.92歲)。其中一側(cè)重度聾、另一側(cè)極重度聾患者6例,雙側(cè)重度聾4例,中度聾1例,其余均為雙側(cè)極重度聾。

1）病史采集

所有研究對象以問卷調(diào)查和電話家訪的形式進(jìn)行病史采集,內(nèi)容包括:①一般情況:姓名、性別、年齡、婚姻狀況、出生日期、家庭住址、長期的聯(lián)系方式;②耳聾特點(diǎn):發(fā)病年齡、有無聽力波動(dòng)、有無伴隨眩暈及耳鳴癥狀、語言發(fā)育情況、助聽器佩戴情況;③用藥史:包括慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、小諾霉素及其他自覺用藥后對聽力有影響的藥物、用藥劑量和持續(xù)時(shí)間;④新生兒期高危因素:耳聾家族史、孕期宮內(nèi)感染、顱面畸形、高膽紅素血癥、腦膜炎、新生兒期缺氧缺血性腦病史、Usher綜合征及Waardenburg綜合征;⑤家族史:父母是否近親結(jié)婚、有無耳聾及其他疾病家族遺傳史;⑥智力發(fā)育情況;⑦母親分娩史:有無臍帶繞頸、難產(chǎn)及產(chǎn)傷。對有家族史的患者繪制相應(yīng)的家系圖譜。

2）體格及聽力檢查

全身體格檢查:對全身各系統(tǒng)、器官及智力和生長發(fā)育進(jìn)行全面的檢查,尤其是甲狀腺,排除因其他系統(tǒng)異常所致的綜合征型聾;②?？撇轶w:排除耳部畸形和化膿性中耳炎等引起的非感音神經(jīng)性聾;③聽力學(xué)檢查:應(yīng)用丹麥生產(chǎn)的Madsen520便攜式聽力儀和美國智聽公司SmartEP聽覺誘發(fā)電位儀對研究對象分別進(jìn)行純音測聽(puretoneaudiometry,PTA)和／或聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢查。并根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO,1997)標(biāo)準(zhǔn)將耳聾程度分為5個(gè)等級:正?！?5dBHL;輕度聾26～40dBHL;中度聾41～60dBHL;重度聾61～80dBHL;極重度聾≥81dBHL。

3）血樣采集及資料保存

在經(jīng)研究對象或其監(jiān)護(hù)人簽訂知情同意書后,抽取患者5～10ml靜脈血,注入存有2mlEDTA抗凝劑的試管中,20oС保存。利用王秋菊等[3]建立的遺傳性聾資源收集、保存和利用的綜合系統(tǒng)對上述內(nèi)容建立詳盡的病案資料。

2.基因檢測方法

1）基因組DNA的制備

用鹽析法提取全血基因組DNA,TE溶解,1%瓊脂糖凝膠電泳定性、定量并利用分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度檢測。制備50～100ng／μl工作液,4oС保存?zhèn)溆谩?/p>

2）目的片段的擴(kuò)增和酶切

利用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)對GJB2第2外顯子、線粒體DNA及SLC26A4第8、19外顯子進(jìn)行擴(kuò)增并使用A1w26I內(nèi)切酶對線粒體基因進(jìn)行酶切反應(yīng),將線粒體酶切陽性標(biāo)本及另外兩基因目的片段送生物公司進(jìn)行測序。

3）測序結(jié)果判讀

將生物公司反饋的測序結(jié)果利用SequenceScannerv1.0和SeqMan與來自NCBI的標(biāo)準(zhǔn)序列(mtDNA:NC＿012920.1;GJB2:NG＿008358.1;SLC26A4:NT＿007933.15)進(jìn)行對比,確定突變位點(diǎn)。

二、結(jié)果

1.mtDNA1555A＞G突變檢測結(jié)果

420例耳聾患者中,11例為mtDNA1555A＞G均質(zhì)性突變所致,占檢測人數(shù)的2.62%(11／420)。其中4例同時(shí)伴有其他位點(diǎn)的堿基改變,2例同時(shí)伴有1438A＞G+1598G＞A的點(diǎn)突變,另外2例同時(shí)伴有1438A＞G+1736A＞G的點(diǎn)突變。11例患者中6例(54.55%,6／11)有明確的氨基糖苷類抗生素用藥史。

2.GJB2突變檢測結(jié)果

420例患者中,41例為GJB2突變所致,包括24例純合突變和17例復(fù)合雜合突變,占所有耳聾患者的9.76%(41／420),是最常見的致聾基因(表1),c.235delC純合突變致病率最高(46.34%,19／41)。還有31例致病基因攜帶者,未發(fā)現(xiàn)顯性致聾基因,GJB2致病等位基因占所有等位基因的13.45%(113／840)。在420例患者中共檢測到14種突變形式,包括9種致聾突變(c.235delC,c.176191del16,c.299300delAT,c.35delG,c.109G＞A,c.439G＞A,c.187G＞T,c.310del14,380G＞A)、兩種常見多肽(c.79G＞A,c.341A＞G)及三種致病性不明確的突變(c.511G＞T,458G＞A,c.478G＞A,其中前兩種是本研究發(fā)現(xiàn)),詳見表2。c.235delC占所有致病等位基因的51.33%(58／113),是該地區(qū)回族NSHL患者的主要突變方式。

3.SLC26A4基因突變檢測結(jié)果

420例患者中共發(fā)現(xiàn)20例(7例為散發(fā)患者,13例為特殊教育學(xué)校的聾生)為雙等位基因改變(純合和復(fù)合雜合),占所有患者的4.76%(20／420)。在840個(gè)等位基因中有42個(gè)c.9192A＞G單等位基因改變,占5.0%(42／840),包括11例純合突變、14例雜合突變和6例與其他點(diǎn)突變共存的復(fù)合雜合(4例與c.2168A＞G共存、2例分別與c.1001+32A＞G和c.1001+5G＞C共存)。c.9192A＞G點(diǎn)突變在所有SLC26A4突變基因中占的比率最高(68.85%,42／61),是該地區(qū)人群的熱點(diǎn)突變(表3)。

三、討論

GJB2、SLC26A4及mtDNA1555A＞G三種常見致聾基因在不同人種、不同地域的耳聾人群中突變頻率和突變方式不盡相同。GJB2基因突變中,c.35delG是歐洲NSHL患者中最常見的突變形式,突變頻率在15%～55.8%之間[1];c.235delC是蒙古人種最常見的突變方式,在國內(nèi)NSHL人群中c.235delC突變頻率約占GJB2等位基因的70%[4,5];SLC26A4基因突變中,c.2168A＞G(p.H723R)是日本人群中的主要突變方式,占SLC26A4等位基因的53%[6];我國以IVS72A＞G最為常見[4,7],內(nèi)陸和臺(tái)灣IVS72A＞G的突變頻率分別占64.63%[8]和84%[9];mtDNA1555A＞G的檢出率低于青海省(5.76%)[10]和西北地區(qū)總體NSHL人群的檢出率(5.21%)[11]。本研究通過對三種常見聾病基因的聯(lián)合篩查明確了本組西北地區(qū)回族約17.14%(72／420)NSHL患者的病因。

本研究在420例回族NSHL患者中共發(fā)現(xiàn)41例(9.76%,41／420)例GJB2突變致聾病例和31例致病基因攜帶者,GJB2致病等位基因占所有等位基因的13.45%(113／840),較Dai等[5]報(bào)道的2063例中國非綜合征型聾患者的檢出率略低。c.35delG是高加索人種的主要突變形式,Li[12]和滿榮軍等[13]報(bào)道在新疆維族發(fā)現(xiàn)該突變,而在漢族人群未發(fā)現(xiàn)該突變,本研究中有6例患者發(fā)現(xiàn)c.35delG等位基因突變(2例純合、2例與c.299300delAT構(gòu)成復(fù)合雜合、2例與c.235delC構(gòu)成復(fù)合雜合)(表1),突變頻率較高,占所有致病等位基因的7.08%(8／113),可能與回族的種族起源有關(guān)。有研究顯示[14],回族人群與高加索人種的混雜度很高。本研究結(jié)果說明,GJB2基因突變是西北地區(qū)回族NSHL患者的主要致病突變,由于回族婚配的局限性,族內(nèi)近親結(jié)婚率較高,因此通過婚育指導(dǎo)可在一定程度上降低該地區(qū)耳聾的發(fā)病率。

SLC26A4是大前庭水管綜合征(enlargeves-tibularaqueductsyndrome,EVAS)的主要致病基因,在國內(nèi)以c.919A＞G和c.2168A＞G為其主要突變方式[15,16]。因此本研究針對上述兩個(gè)突變位點(diǎn)所在的外顯子進(jìn)行檢測分析,結(jié)果示c.9192A＞G突變頻率為5.0%,介于國內(nèi)不同地區(qū)的發(fā)病率之間(0.04%～19.9%)[17]。本組中有114例散發(fā)耳聾患者,其中7人為雙等位基因改變,占散發(fā)患者的6.14%(7／114),高于特殊教育學(xué)校聾生的檢出率(4.25%,13／306),分析其可能原因?yàn)?EVA患者聽力有波動(dòng)性,散發(fā)病例中患者耳聾程度不一,有佩戴助聽器的患者和語后聾而未能就讀于特殊學(xué)校的患者;Wang等[15]在對95例EVA患者基因型與表型的研究中發(fā)現(xiàn)SLC26A4所致的耳聾表型以重度聾最常見(多數(shù)為IVS72A＞G突變所致),中度聾次之,極重度聾較少,而特殊教育學(xué)校的學(xué)生絕大多數(shù)為重度和極重度聾患者,故散發(fā)病例中的檢出率較特殊教育學(xué)校學(xué)生中高。目前國內(nèi)外耳聾研究對象多以聾啞學(xué)生為主,而很少以散發(fā)耳聾患者作為研究對象,而同一地區(qū)、同一民族散發(fā)患者與特殊教育學(xué)校的患者SLC26A4突變率是否相同,聾啞學(xué)生的突變率是否可以反映整個(gè)地區(qū)的突變率,均有待于進(jìn)一步研究。

mtDNA1555A＞G突變是氨基糖苷類抗生素相關(guān)致聾基因,中國西北地區(qū)由于經(jīng)濟(jì)落后,該類抗生素使用廣泛,明顯高于國內(nèi)其他地區(qū)[4,18]。本研究中11例為mtDNA1555A＞G均質(zhì)性突變所致,占檢測人數(shù)的2.62%(11／420),與Guo等[4]報(bào)道的303例回族患者的檢出率相近,與漢族患者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于線粒體母系遺傳的特點(diǎn),加之種族起源和抗生素在不同地區(qū)使用廣泛程度不同,使得該基因在不同種族、不同地區(qū)的致病率有很大的差異。本組11例mtDNA1555A＞G基因突變患者中,6例有明確的氨基糖苷類抗生素用藥史,占病因明確患者的54.55%(6／11),因此,減少該類抗生素的使用對防止藥物性聾具有至關(guān)重要的作用。

本研究通過對三種常見聾病基因的聯(lián)合篩查,將為中國