植物生物技術(shù)重點

生物技術(shù)的定義生物技術(shù)(biotechnology)，也稱生物工程(bioengineering),是指以現(xiàn)代生命科學(xué)為根底,結(jié)合先進的工程技術(shù)手段和其他根底科學(xué)的科學(xué)原理,按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料,為人類生產(chǎn)出所需要的產(chǎn)品或到達某種目的的一系列技術(shù)?，F(xiàn)代植物生物技術(shù)包括：植物組織培養(yǎng)技術(shù)，人工種子技術(shù)，細胞工程技術(shù)，基因工程技術(shù)植物組織培養(yǎng)定義在人工操作下把離體植物器官〔根、莖、葉、花、果〕、植物組織〔表皮、胚、胚乳、形成層、愈傷組織〕、植物的細胞〔游離的體細胞、大小孢子〕和植物的原生質(zhì)體在無菌的條件下培養(yǎng)，使它們繼續(xù)生長、發(fā)育成完整植株的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)〔Invitroculture〕或試管培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用育種上的應(yīng)用：單倍體育種：快速純化個體，縮短育種年限，提高育種效率等作用。遠緣雜交：克服雜交不親和性，用于植物的遠緣雜交；體細胞雜交；胚珠培養(yǎng)。體細胞變異的應(yīng)用：果樹苗木等。單細胞突變體的篩選：抗性育種種子繁育與生產(chǎn)：快速繁育：蘭花、香蕉、甘蔗、咖啡等。獲得脫毒植株，提高種性：病毒可通過維管束傳遞，莖尖細胞分裂很旺，幾乎沒有病毒，如土豆。人工種子：不受氣候影響，苜蓿、芹菜、胡蘿卜等。植物產(chǎn)品的工廠化生產(chǎn)：喜樹的喜樹堿〔抗癌〕，人參皂苷，香料植物的香油精。種質(zhì)資源的保存對于難于產(chǎn)生種子，種子不易保存，或珍稀的植物。番薯的塊根保存很難，可以取其莖尖進行組織培養(yǎng)，進行保存培養(yǎng)基種類據(jù)其營養(yǎng)水平分：根本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基據(jù)其態(tài)相分：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基據(jù)其作用分：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程分：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基主要有：MS、White、N6、B5、Heller、Nitsch、Miller、KM-8PMS培養(yǎng)基--大量元素。特點：無機鹽的濃度高，具有高含量的氮、鉀，尤其硝酸鹽的用量很大，同時還含有一定數(shù)量的銨鹽，這使得它營養(yǎng)豐富，不需要添加更多的有機附加物，就能滿足植物組織對礦質(zhì)營養(yǎng)的要求，有加速愈傷組織和培養(yǎng)物生長的作用，當培養(yǎng)物久不轉(zhuǎn)移時仍可維持其生存N6培養(yǎng)基特點：KNO3和(NH4)2SO4含量高，不含鉬。目前在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花粉和花藥培養(yǎng)和組織培養(yǎng)B5培養(yǎng)基特點：含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。銨鹽可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用，但它適合于有些植物如雙子葉植物特別是木本植物的生長。滅菌：用物理或化學(xué)方法，殺死物體外表和孔隙內(nèi)一切微生物或生物體，即所有生命的物質(zhì)全部殺死。物理滅菌：高溫高壓滅菌、干熱滅菌(烘燒和灼燒)、濕熱滅菌、輻射(紫外線、超聲波、微波)滅菌、過濾滅菌?；瘜W(xué)滅菌：酒精、升汞、過氧化氫、高錳酸鉀、次氯酸鈉、抗生素等化學(xué)藥品處理，根據(jù)工作中的不同材料不同目的適中選用。包括：熏蒸滅菌、噴霧滅菌、消毒液滅菌。培養(yǎng)基一般采用濕熱滅菌法，壓力108kPa、溫度為121℃時，維持20min，即可到達滅菌的目的。某些激素〔如GA3、ZT、IAA〕、抗生素以及某些維生素等，遇熱時容易分解，不能進行高壓滅菌，用過濾滅菌。外植體消毒外植體的成苗途徑：1愈傷組織2胚狀體3器官發(fā)生4原球莖途徑培養(yǎng)基的成分水，無機鹽有機成分，植物生長調(diào)節(jié)劑，碳源，凝固劑其它附加物無機營養(yǎng)：無機物中有16種是植物必須的，即C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl當某些營養(yǎng)元素的供給缺乏時，愈傷組織生長和發(fā)育會出現(xiàn)一些特殊的病癥，如：

缺氮：表現(xiàn)出一種很注目的花色素苷的顏色，愈傷組織不能形成導(dǎo)管；

缺鉀或磷：細胞過度生長，形成層組織減退；

缺硫：愈傷組織褪綠；

缺鐵：細胞分裂停止；

缺硼：細胞分裂停滯，細胞伸長；而缺錳銅那么會影響細胞伸長。2、有機成分--氨基酸：氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是一種有機氮化合物。有機氮作為培養(yǎng)基中的惟一氮源時，離體組織生長不良，只有在含有無機氮的情況下，氨基酸類物質(zhì)才有較好的效果。維生素：能明顯地促進離體組織的生長。培養(yǎng)基中的維生素主要是B族維生素天然有機物：有機附加物包括有些成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳(CM)、香蕉泥、番茄汁(TJ)、馬鈴薯泥、蘋果汁、生梨汁、西瓜汁、酵母提取液〔YE〕、麥芽浸出物〔ME〕等。有機成分--肌醇肌醇：環(huán)己六醇，幫助活性物質(zhì)作用

其他：單核苷酸等。碳源：糖在植物組織培養(yǎng)中是不可缺少的。它不但作為離體組織賴以生長的碳源，且還能使培養(yǎng)基維持一定的滲透壓〔一般培養(yǎng)基滲透壓維持在1.5～4.1MPa〕。激素：激素對愈傷組織的誘導(dǎo)、器官分化及植株再生具有重要的作用.培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì):主要包括生長素、細胞分裂素、赤霉素〔GA3〕、脫落酸〔ABA〕、乙烯。生長素：生長素能影響植物莖和節(jié)間的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落、生根等現(xiàn)象。離體培養(yǎng)中的作用：誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生；促進細胞脫分化；促進細胞的伸長；促進生根。常用的生長素有吲哚乙酸〔IAA〕、吲哚丁酸〔IBA〕、萘乙酸〔NAA〕、2，4—二氯苯氧乙酸〔2，4－D〕。IAA、NAA、IBA、2,4-D之類生長素，可先用少量0.1N氫氧化鈉或乙醇溶解，然后再定容到所需要的體積。細胞分裂素：細胞分裂素影響植物細胞分裂、頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化等。培養(yǎng)基中參加細胞分裂素，主要是為促進細胞分裂和由愈傷組織形成器官，分化不定芽。由于這類化合物有助于解除頂端優(yōu)勢對腋芽的抑制作用，可用于莖的增殖。細胞分裂素有天然的和人工合成的。常用的有TDZ、玉米素〔ZT〕、芐氨基腺嘌呤〔6－BA〕、沖動素〔KT〕等。激素：組培中決定愈傷組織生根還是生芽的關(guān)鍵取決于細胞分裂素與生長素之間的比率。當配制的培養(yǎng)基中生長素/細胞分裂素的比例高時那么有利于生根；生長素/細胞分裂素的比例低時那么有利于生芽；假設(shè)兩者濃度相當時，既不利于生根，也不利于生芽，而是愈傷組織的產(chǎn)生占優(yōu)勢。赤霉素能刺激在培養(yǎng)中形成的不定胚發(fā)育成小植株。脫落酸：ABA在植物組織培養(yǎng)中對培養(yǎng)物有間接的抑制作用，它可抑制外植體形成體細胞胚狀體。加ABA形成的抑制劑〔硝酸銀〕，銀離子與ABA的前體相結(jié)合，抑制了ABA的形成。

水楊酸〔阿司匹林〕：水楊酸能抑制ABA的形成，有利于胚狀體的形成。凝固劑：在固體培養(yǎng)時，瓊脂是使用最方便、最好的凝固劑。瓊脂是一種高分子的碳水化合物，以色白、透明、潔凈的為佳，僅溶解于熱水，冷后〔40℃以下〕即凝固為固體狀的凝膠。瓊脂糖：原生質(zhì)體培養(yǎng)時用。Phytogel：新型凝固劑。水：植物組織培養(yǎng)所必需培養(yǎng)基的配制必須用超純水細胞培養(yǎng)主要用蒸餾水活性碳；活性炭參加培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，如防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。這在蘭花組織培養(yǎng)中效果更明顯?；钚蕴渴古囵B(yǎng)基變黑，有利于某些植物生根?；钚蕴繉ξ镔|(zhì)吸附無選擇性，因此使用時應(yīng)慎重考慮，不能過量，一般用量為0.1％～0.5％?；钚蕴繉π螒B(tài)發(fā)生和器官形成有良好的效應(yīng)。植物細胞全能性理論〔Haberlandt,1902〕植物體的每個細胞都具有發(fā)育成一個完整植株的潛在能力，細胞的這種特性叫做細胞全能性。細胞具有這種潛能是因為每個細胞都包含了這個物種的所特有的全套遺傳物質(zhì)，具有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因。脫分化：指高度分化的植物器官、組織或細胞，在離體培養(yǎng)條件下經(jīng)過屢次細胞分裂逐漸失去原來的結(jié)構(gòu)、功能和分化狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的愈傷組織或細胞團的過程。胚培養(yǎng)分成熟胚培養(yǎng)和未成熟胚〔幼胚〕培養(yǎng)。胚培養(yǎng)的意義1克服遠緣雜交不親和性和雜種不育性，獲得種間或?qū)匐s種2獲得單倍體植株3克服種子休眠，提早結(jié)實4縮短育種周期，提高育種效率5種子生活力的快速測定6稀有植物品種的繁殖愈傷組織的過程啟動期〔誘導(dǎo)期〕：為細胞分裂做準備，細胞大小不變，合成代謝活潑，RNA含量增加，核體積增大；分裂期：外層細胞開始分裂，細胞變小，當體積最小，細胞核和核仁最大，細胞內(nèi)無大液泡，RNA含量最高時，進入頂峰；分化期〔形成期〕：細胞分裂深入到局部內(nèi)部，形成擬分生組織，最后可以分化成維管組織。酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)：又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶，是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。DNA連接酶;一種能夠催化在2條DNA鏈核苷酸5′-磷酸基團和3′-OH之間形成磷酸二酯鍵的酶DNA連接酶：由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子；T4DNA連接酶：由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，以ATP作為能源輔助因子。容易制備，而且可以連接完全配對的平末端DNA分子，所以在基因克隆中應(yīng)用廣泛DNA聚合酶:大腸桿菌DNA聚合酶I它是一種多功能性的酶，包括3種不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性：以雙鏈DNA為模板，催化單核苷酸通過核苷酸5′-磷酸基團和3′-OH之間通過磷酸酯鍵結(jié)合到引物的3′末端，并不斷延伸；5′-3′外切酶活性：該活性能夠保證DNA分子從5′→3′方向解離。3′-5′外切酶活性：這種外切核酸酶的活性能夠保證被錯誤連接到DNA鏈上的核苷酸被切割下來,然后連接上一個正確的核苷酸分子。Klenow片段Klenow片段大腸桿菌聚合酶I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途：限制性酶消化DNA形成的3′末端補平標記DNA片段的末端cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成DNA序列的測定T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶是從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中別離出來的，和Klenow片段一樣具有5′→3′的聚合酶和3′→5′外切酶的活性。外切酶活性比大腸桿菌聚合酶I的高200倍。T4DNA聚合酶還有第三種活力--取代反響：如果反響體系中僅存在一種dNTP，這時T4DNA聚合酶就會表現(xiàn)出3′→5′外切酶活力，從雙鏈DNA的3′開始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互補的堿基，然后就在此位置發(fā)生合成和取代反響。4〕TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和純化對于PCR技術(shù)產(chǎn)生和廣泛應(yīng)用〔DNA體外擴增、基因克隆等〕具有重要的奉獻。逆轉(zhuǎn)錄酶：是一種可以有效地將mRNA轉(zhuǎn)錄成為DNA的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA(complementaryDNA)。實際上，它也是一種RNA依賴的DNA聚合酶。主要用途是將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA以制備基因片段。末端轉(zhuǎn)移酶的特性末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，將核苷酸連接到DNA的在3‘羥基，特別是對于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有效。最常見的用途是在酶切產(chǎn)生的平末端加尾以便于創(chuàng)造粘性的互補末端載體(vector)：在細胞中能夠自主復(fù)制的DNA分子，通常用于裝載外源的DNA片段或者基因，并轉(zhuǎn)入受體的細胞，使外源DNA分子能夠在受體細胞中進行復(fù)制。功能：克隆載體：克隆一個基因或DNA片斷。表達載體：用于一個基因的蛋白表達。整合載體：把一個基因插入到染色體組中載體應(yīng)具備的特性1克隆載體的DNA分子上通常含有1個或多個克隆位點供外源的DNA片段插入到克隆載體上。2、攜帶有外源的DNA片段(基因)進入到宿主細胞中能夠進行自我復(fù)制，或者外源的DNA片段能夠整合染色體隨著染色體的DNA復(fù)制而同步進行自我的復(fù)制。3、載體必須具有可供選擇的標記,如抗生素標記。4、載體必須是平安的,不含有對受體細胞有害的基因,對于細胞的生長不會產(chǎn)生顯著的影響。質(zhì)粒載體理想的質(zhì)粒載體1、分子量小，多拷貝，易操作；2、本身能進行自我復(fù)制；3、具有一種或多種酶單切位點；4、具有2個或多個選擇標記基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建的根本原那么1、質(zhì)粒載體具有能自我復(fù)制的元件，自我增值的根本條件，一般具一個復(fù)制子；ori。2、質(zhì)粒載體上具有允許外源基因插入的多克隆位點；3、質(zhì)粒載體上同時必須有可供篩選的抗生素標記，Ampr、Kanr；4、構(gòu)建的質(zhì)粒載體應(yīng)該足夠小。其它：強啟動子；增強子；強終止子。質(zhì)粒載體的一般生物學(xué)特性質(zhì)粒DNA的自主復(fù)制：嚴謹型〔<10拷貝〕、松弛型〔>10拷貝〕2、質(zhì)粒DNA的不親和性：能夠在同一個宿主細胞中共存的不同的質(zhì)粒稱為親和性質(zhì)粒,不能在同一個宿主細胞中共存的質(zhì)粒稱為不親和性質(zhì)粒。一種質(zhì)粒與其衍生的質(zhì)粒之間或親緣關(guān)系較近放入往往為不親和性的質(zhì)粒。DH5α3、質(zhì)粒的DNA接合性：使遺傳物質(zhì)從宿主細胞向受體細胞中轉(zhuǎn)移。λ噬菌體載體噬菌體生長周期：溶菌周期和溶源周期溶菌周期：指噬菌體將DNA注入寄主細胞后很快環(huán)化，然后進行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。在溶源周期中，注入寄主細胞的噬菌體DNA是整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復(fù)制。噬菌體的特征：烈性噬菌體：只有溶菌生長周期的噬菌體。溫和噬菌體：只有溶源周期的噬菌體。溶源性細菌：整合了一套完整的噬菌體基因組的細菌。原噬菌體：在溶源性細菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA。λ噬菌體的特征：噬菌體的DNA分子注入細菌細胞；噬菌體的DNA分子插入到細菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體；細菌繼續(xù)生長、增值，噬菌體的基因作為細菌染色體的一局部進行復(fù)制。λDNA：線狀雙鏈DNA分子，約為48kb，在兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。注入到寄主細胞中后，可以通過粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。通過粘性末端互補形成的雙鏈區(qū)稱為cos位點(cohesiveendsite)。λ噬菌體載體的改造①引入可供篩選的標記基因；②剔除不必要的序列和酶切位點,引入新的酶切位點；載體片段的連接。載體環(huán)化后轉(zhuǎn)入到宿主菌中進行繁殖λ噬菌體載體的主要用途是構(gòu)建cDNA文庫?？滤官|(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體多克隆位點區(qū)含有cos位點的λDNA區(qū)具有質(zhì)粒載體的自我復(fù)制起點ori和抗性標記區(qū)被用于基因組文庫的構(gòu)建工作特點：具有λ噬菌體的特性：柯斯質(zhì)粒連接上適宜長度的外源DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主細胞。進入寄主細胞的DNA也能環(huán)化和復(fù)制，但是不會形成新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。具有質(zhì)粒載體的特性：能象質(zhì)粒一樣在寄主細胞內(nèi)復(fù)制，且?guī)в锌剐赃x擇標記基因和多克隆位點，為重組體的篩選提供了方便。高容量的克隆能力：cos質(zhì)粒本身很小，只有復(fù)制起點、選擇標記和cos位點等構(gòu)成，所以其克隆上限可達45kb左右。不過由于包裝的限制，其克隆片段至少要到達30kb。人工染色體載體〔BAC〕來源：E.coli的性因子小F1因子為根本骨架。容量：插入達300kb左右的DNA片段應(yīng)用大規(guī)模的作圖與測序：基因組物理圖譜的構(gòu)建；基因組測序；圖位克隆基因：用該方法克隆基因無需知道基因產(chǎn)物等信息,只需知道該基因在染色體上的位置；著絲粒的研究；BAC-FISH對重要基因進行定位；利用BAC-FISH對近緣種進行比擬物理定位和作圖基因文庫〔genelibrary〕是指聚集了某一生物基因組DNA全部序列的重組體DNA群體〔轉(zhuǎn)化子群〕?；蚪M文庫的大小〔即應(yīng)該包含多少個獨立的克隆〕與基因組本身的大小和克隆DNA片段的平均大小有關(guān)。植物基因組文庫的構(gòu)建的步驟：1、大片段DNA克隆載體的準備；2、大分子質(zhì)量的植物基因組DNA制備；3、大片段DNA分子的局部酶切；4、載體與外源片段的連接；5、載體的遺傳轉(zhuǎn)化；6、克隆的挑取和驗證及植物基因組文庫的保存基因組文庫的構(gòu)建根本原那么①文庫能夠覆蓋整個基因組；水稻：430Mb；人類：2.9Gb；②插入的片段比擬大：文庫比擬穩(wěn)定,且容易保存。植物組織培養(yǎng)過程:外植體外植體愈傷組織器官或胚胎完整植株脫分化再分化脫分化再分化激素激素基因克隆的本質(zhì)是把某一目標DNA片段通過無性的方式進行擴增和表達，而這一過程往往是通過載體和寄主細胞來實現(xiàn)的。目前，以大腸桿菌為寄主，以質(zhì)粒和噬菌體等為載體的基因克隆體系已經(jīng)相當?shù)某墒?。根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的具體技術(shù)--水稻為例(1)水稻愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代(2)農(nóng)桿菌的制備(3)水稻愈傷與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)(4)洗菌(5)抗性愈傷組織的篩選(6)愈傷組織的分化(7)再生植株的生根、煉苗和移栽土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)點：1〕該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，成功率高，效果好；〔2〕目前對該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究最清楚，方法最成熟，應(yīng)用也最廣泛；〔3〕Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)可以容納相當大的DNA片斷插入，目前已把長達50kb的異源DNA序列通過T-DNA完整地轉(zhuǎn)移到植物細胞中；〔4〕T-DNA上含有引導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移和整合的序列，以及能夠被高等植物細胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識別的功能啟動子和轉(zhuǎn)錄信號，使插入到T-DNA區(qū)的外源基因能夠隨同T-DNA一道在植物中表達；〔5〕整合進植物基因組中的T-DNA及插入的外源基因可以根據(jù)不同的需要，通過連接不同的啟動子進行特異表達；〔6〕外源基因多以單拷貝插入，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律，因此較好地為育種提供可選育的材料。發(fā)根農(nóng)桿菌入侵植物傷口后，不是產(chǎn)生瘤，而是產(chǎn)生大量不定根，呈毛狀，稱毛狀根或發(fā)狀根。這是由于發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中Ri質(zhì)?！瞨oot-inducingplasmid〕決