2.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)課件

第二章、染色體與DNA2.3、DNA的復(fù)制自由草12.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)主要概念：DNA的復(fù)制DNA的半保留復(fù)制DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制叉復(fù)制子自由草22.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)DNA的復(fù)制

(DNAReplication)由于DNA分子由兩條多核苷酸鏈組成，兩條鏈上的堿基——G只能與C相配對(duì)，A只能與T相配對(duì)，所以，兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，一條鏈上的核苷酸排列順序決定了另一條鏈上的核苷酸排列順序。自由草32.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)DNA的半保留復(fù)制

（semi-conservativereplication）DNA在復(fù)制過(guò)程中，每條鏈分別作為模板合成新鏈，產(chǎn)生互補(bǔ)的兩條鏈。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與原來(lái)DNA分子的堿基順序完全一樣。因此，每個(gè)子代分子的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式被稱(chēng)為DNA的半保留復(fù)制。自由草42.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)DNA的半保留復(fù)制Semi-conservativemechanism15Nlabelingexperiment1958年，Meselson和Stahl研究了經(jīng)15N標(biāo)記3個(gè)世代的大腸桿菌DNA，首次證明了DNA的半保留復(fù)制。DNA的半保留復(fù)制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性，與DNA的遺傳功能相符合。自由草52.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)DNA的半不連續(xù)復(fù)制

（semi-discontinuousreplication）由于DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此在?fù)制叉附近解開(kāi)的DNA鏈一條是5'→3'方向，另一條是3'→5'方向，兩個(gè)模板極性不同。而所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5'→3'，兩條鏈無(wú)法同時(shí)進(jìn)行復(fù)制。為了解釋DNA的等速?gòu)?fù)制現(xiàn)象，日本學(xué)者岡崎（Okazaki）等提出了DNA的半不連續(xù)復(fù)制模型。自由草62.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)后隨鏈的合成前導(dǎo)鏈的合成自由草72.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)半不連續(xù)復(fù)制Semi-discontinuousreplication:

岡崎片段Okazakifragment[3H]Thymidinepulse-chaselabelingandalkalinesucrosegradient:discoveryofsemi-discontinousreplication自由草82.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)1、用3H脫氧胸苷短時(shí)間標(biāo)記后提取DNA，得到不少平均長(zhǎng)度為2-3kbDNA片段。2、用DNA連接酶溫度敏感突變株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在連接酶不起作用的溫度下，有大量小片段累積，說(shuō)明復(fù)制過(guò)程中至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段，然后再生成大分子DNA。3、前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性的，因而稱(chēng)之為DNA的半不連續(xù)復(fù)制。自由草92.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)半不連續(xù)復(fù)制生物化學(xué)教學(xué)課件自由草102.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)半不連續(xù)復(fù)制岡崎片段：間斷的后隨鏈片段自由草112.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA要解開(kāi)成兩股鏈分別進(jìn)行，所以，復(fù)制起點(diǎn)呈叉子形式，被稱(chēng)為復(fù)制叉(Replicationfork)。DNA的復(fù)制是由固定的起始點(diǎn)開(kāi)始的。一般把生物體的復(fù)制單位稱(chēng)為復(fù)制子（replicon），一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。自由草122.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)

正在復(fù)制的部分在電鏡下象只眼睛,稱(chēng)復(fù)制眼（泡）自由草132.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制過(guò)程復(fù)制叉的移動(dòng)方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈隨后鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的延長(zhǎng)DNA鏈終止5′RNA引物3′3′復(fù)制過(guò)程可分為：自由草142.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)152.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)參與原核生物DNA復(fù)制的有關(guān)酶類(lèi)(peimase)(topoisomerase)(DNAhelicase)（DNAligase）(single-strandbindingprotein,SSB)(DNApolymetases)自由草162.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)自由草172.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)自由草182.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)自由草192.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)細(xì)菌、病毒和線粒體的DNA分子都是作為單個(gè)復(fù)制子完成復(fù)制的；真核生物基因組可以同時(shí)在多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)上進(jìn)行雙向復(fù)制，也就是說(shuō)它們的基因組包含有多個(gè)復(fù)制子。部分生物復(fù)制子的比較自由草202.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)2.3.3復(fù)制的幾種主要方式2.3.3.1線性DNA雙鏈的復(fù)制2.3.3.2環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制(1)θ型(2)滾環(huán)型(rollingcircle)(3)D-環(huán)型(D-loop)自由草212.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制-θ型大腸桿菌質(zhì)粒DNA雙向復(fù)制的模式與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。上：θ形復(fù)制模式圖；下：3H標(biāo)記質(zhì)粒DNA合成圖。自由草222.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)

1968年Gilbert提出滾環(huán)復(fù)制模型:（1）共價(jià)延伸；（2）模板鏈和新合成的鏈分開(kāi)；（3）不需RNA引物，在正鏈3'－OH上延伸；（4）只有一個(gè)復(fù)制叉；（5）形成多聯(lián)體（concatemer）。

自由草232.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)D-環(huán)型（D-loops）Dloop是單向復(fù)制的特殊方式。首先在動(dòng)物線粒體中被發(fā)現(xiàn)。一條短RNA與一條DNA互補(bǔ)，取代了該區(qū)域原來(lái)的互補(bǔ)的DNA鏈，使得兩條鏈的合成高度不對(duì)稱(chēng)，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則為游離的單環(huán)。自由草242.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)2.4原核生物和真核生物

DNA的復(fù)制特點(diǎn)自由草252.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)2.4.1原核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)大腸桿菌基因組以雙鏈環(huán)狀DNA分子的形式存在，其DNA復(fù)制的中間產(chǎn)物可形成一個(gè)θ，復(fù)制從定點(diǎn)開(kāi)始雙向等速進(jìn)行。復(fù)制起始后，兩個(gè)復(fù)制叉在距起始點(diǎn)180°處會(huì)合。自由草262.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)大腸桿菌DNA復(fù)制起始點(diǎn)（OriC）

保守序列分布圖大腸桿菌DNA的復(fù)制起始點(diǎn)（OriC）含有3個(gè)13bp的串聯(lián)重復(fù)保守序列，GATCTNTTNTTTT，以及4個(gè)由9bp的保守序列（TTATNCANA）組成的能夠結(jié)合DnaA的起始結(jié)合位點(diǎn)。識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)自由草272.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)2.4.1.1DNA雙螺旋的解旋首先，在拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用下解開(kāi)負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)處解開(kāi)雙鏈。解鏈過(guò)程中必需有SSB蛋白來(lái)穩(wěn)定已解開(kāi)的單鏈，以保證該局部結(jié)構(gòu)不會(huì)恢復(fù)成雙鏈。接著，由引發(fā)酶等組成的引發(fā)體迅速作用于兩條單鏈DNA上。不論是前導(dǎo)鏈還是滯后鏈，都需要一段RNA引物以開(kāi)始子鏈DNA的合成。自由草282.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)（1）DNA解鏈酶（DNAhelicase）大部分DNA解鏈酶都沿滯后鏈模板的5'→3'方向并隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，只有Rep蛋白沿前導(dǎo)鏈模板的3'→5'方向移動(dòng)。因此，Rep蛋白和其他DNA解鏈酶分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用，解開(kāi)雙鏈DNA。自由草292.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)(2)單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）大部分原核SSB蛋白與DNA結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)：如第一個(gè)SSB蛋白結(jié)合到DNA上去的能力為1，第二個(gè)SSB結(jié)合能力則可高達(dá)103。SSB蛋白的作用是穩(wěn)定單鏈DNA。又稱(chēng)為雙螺旋去穩(wěn)定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177個(gè)aa組成在E.coli中以四聚體存在分子量為74KDa在原核中SSB與DNA結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。（1）SSB之間的相互作用；（2）第一個(gè)SSB和DNA的結(jié)合改變了DNA的結(jié)構(gòu)。自由草302.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。生物化學(xué)教學(xué)課件E-AMPE-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5‘-PO4上使其活化活化的5'-PO4與相鄰的3'-OH作用形成3'-5'磷酸二酯鍵，并釋放出AMP(3)DNA連接酶自由草312.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)(3)DNA連接酶

其作用機(jī)制是分三步進(jìn)行：1、E＋ATP→E-AMP＋ppi在E.coli中，E＋NAD→E-AMP＋NMN（煙酰胺單核苷酸）2、E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5‘-PO4上使其活化3、活化的5'-PO4與相鄰的3'-OH作用形成3'-5'磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。自由草322.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)2.4.1.3復(fù)制的引發(fā)和終止DNA聚合酶只能延長(zhǎng)已存在的DNA鏈，而不能從頭合成DNA鏈，那么，新DNA的復(fù)制是怎樣開(kāi)始的呢？研究發(fā)現(xiàn)，DNA復(fù)制時(shí)，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3’端開(kāi)始合成新的DNA鏈。滯后鏈的引發(fā)過(guò)程比較復(fù)雜，需要多種蛋白質(zhì)和酶的協(xié)同作用，還牽涉到岡崎片段的形成和連接。自由草332.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)滯后鏈的引發(fā)過(guò)程由引發(fā)體（primosome）來(lái)完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n、n’、n’’、DnaB、C和I共同組成，只有當(dāng)引發(fā)前體（preprimosome）把這6種蛋白質(zhì)合在一起并與引發(fā)酶（primase）進(jìn)一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功能。自由草342.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)引發(fā)體在滯后鏈分叉的方向上前進(jìn)，并在模板上間斷性引發(fā)生成滯后鏈引物---RNA短鏈，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直至遇到下一個(gè)引物或?qū)槠螢橹埂Ｓ蒖NaseH降解RNA引物并由DNA聚合酶I將缺口補(bǔ)齊，再由DNA連接酶將兩個(gè)岡崎片段連在一起形成大分子DNA。自由草352.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)

鏈的終止需要Tus蛋白參與當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20bp重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。自由草362.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)大腸桿菌中DNA復(fù)制的終止自由草372.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)

DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ結(jié)構(gòu)分子量

109KD90KD900KD構(gòu)成

單體單體異多聚體分子數(shù)/細(xì)胞

400？10-20酶活性：5'→3'聚合酶

+++3'→5'外切酶

+++5'→3'外切酶

+－－(可切單鏈)突變體突變位點(diǎn)polApolBpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dnaT突變表型修復(fù)有缺陷能修復(fù)阻止復(fù)制大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質(zhì)比較自由草382.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)DNA聚合酶的共同點(diǎn)：1、都以dNTP為底物。2、都需要Mg2+激活。3、聚合時(shí)必須有模板鏈和具有3‘-OH末端的引物鏈。不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3’-OH。4、鏈的延伸都方向?yàn)?‘→3’。5、除聚合DNA外還有其它功能。自由草392.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)2.4.2真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)自由草402.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)SV40:apolyomavirus（多瘤病毒）thatisveryusefulforstudyingeukaryotic（真核）replicationenzymes自由草412.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)真核生物DNA的復(fù)制子被稱(chēng)為ARS（autonomouslyreplicatingsequences，自主復(fù)制序列），長(zhǎng)約150bp左右，包括數(shù)個(gè)復(fù)制起始必需的保守區(qū)。真核生物DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有50bp/秒。因此，人類(lèi)DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。真核細(xì)胞中有5種DNA聚合酶，分別稱(chēng)為DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε。不同ARS序列的共同特征是有一個(gè)被稱(chēng)為A區(qū)的11bp的保守序列自由草422.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)真核生物DNA聚合酶的特性比較自由草432.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)DNA聚合酶α主要參與引物合成。DNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。DNA聚合酶δ是主要負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的酶。DNA聚合酶ε的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口補(bǔ)全。自由草442.3和2.4-DNA的復(fù)制和特點(diǎn)2.4.3DNA復(fù)制的調(diào)控DNA鏈延伸的速度在同種生物的不同細(xì)胞中幾乎是恒定的，只是復(fù)制叉的數(shù)量不同。迅速分裂的細(xì)胞具較多的復(fù)制叉，而分裂緩慢的細(xì)胞復(fù)制叉較少并出現(xiàn)復(fù)制的間隙。復(fù)制起始頻率的直接調(diào)控因子