GB∕T 39920-2021 蛙病毒感染檢疫技術(shù)規(guī)范(正式版)

GB/T39920—2021蛙病毒感染檢疫技術(shù)規(guī)范國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會—GB/T39920—2021—本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC156)歸口。1GB/T39920—2021蛙病毒感染檢疫技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)給出了兩棲類動物蛙病毒感染(infectionwithRanavirus)的臨床癥狀，規(guī)定了蛙病毒感染2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T18088出入境動物檢疫采樣CPE:細胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect)CTAB:十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammoniumbromide)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dATP:三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(deoxyadenosinetriphosphate)dCTP:三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(deoxycytidinetriphosphate)dGTP:三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(deoxyguanosinetriphosphate)dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)dTTP:三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(deoxythymidinetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay)EPC:鯉上皮瘤細胞系(epitheliomapapulosumcyprinicellline)HEPES:4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid]IgG:免疫球蛋白G(immunoglobulinG)MCP:主衣殼蛋白(majorcapsidprotein)OD:光密度(opticaldensity)PBST:含有Tween-20的磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsalineTween-20)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)Taq:水生棲熱菌(thermusaquaticus)24試劑或材料4.9MgCl?:25mmol/L,—20℃保存。a)正向引物F:5'CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GAT-GT3';b)反向引物R:5'AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AAA-C3';3用組織研磨器將樣品勻漿成糊狀，按1:10的比例將其重懸于含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)液(見附錄B中B.1)中，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～24h。用細胞培養(yǎng)液對1:10的組織勻漿上清液再做2次10倍稀釋，然后將1:10、1:100和1:1000三個稀釋度的上清液接種到生長約24h的EPC單層細胞上(96孔板中),每個樣品至少接種3孔，每孔接種100μL,置于25℃培養(yǎng)。試驗設(shè)置3孔陽性對照(接種病毒參考株)和3孔空白對照(未8.1.2.3如果空白對照細胞形態(tài)正常，陽性對照孔細胞出現(xiàn)CPE,當(dāng)接種被檢勻漿上清稀釋液的細胞8.2PCR檢測8.2.2DNA抽提離心5min,取上層水相(約600μL),4GB/T39920—20218.2.3PCR擴增在PCR管中加入以下試劑：10×PCR緩沖液(不含Mg2+)10μL、25mmol/L的MgCl?10μL、用1×電泳緩沖液(見B.7)配制1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.5pg/mLEB,見B.8,或其他經(jīng)過驗證的等效染色試劑)。將5μL樣品和1pL6×上樣緩沖液(見B.9)混勻后加入樣品孔進行電泳。電泳結(jié)束8.2.5設(shè)立對照8.2.5.2取含有已知蛙病毒參考株的細胞懸液或已知感染蛙病毒的組織作為陽性對照。8.2.5.3取正常的細胞懸液或陰性組織作為陰性對照。8.2.5.4取等體積的水代替模板作為空白對照。8.2.6.1PCR產(chǎn)物電泳后，陽性對照會出現(xiàn)585bp的DNA片段，陰性對照和空白對照均沒有該核酸帶。8.2.6.2待測樣品PCR擴增后，在585bp的位置上有條帶者，切膠后進行測序。8.2.6.3將測序獲得序列(參見附錄C)與已知的蛙病毒MCP基因序列進行比對，如果與其同源性最近8.3ELISA檢測8.3.1.1用pH9.6的包被液(見B.10)按說明書稀釋純化的蛙病毒單克隆抗體，包被ELISA板，每孔8.3.1.2用含0.05%Tween-20的0.01mol/LPBS(PBST,見B.12)洗3次。8.3.1.4加入2倍或4倍系列稀釋的待測樣品或者病毒培養(yǎng)液、蛙病毒參考株(陽性對照)、正常組織樣品(陰性對照)和細胞培養(yǎng)液(空白對照),各加2孔，每孔100μL,37℃孵育1h。PBST洗3次。8.3.1.5將山羊抗蛙病毒血清用細胞培養(yǎng)液稀釋到工作濃度，每孔加100μL,37℃孵育1h。PBST洗3次。8.3.1.6加入0.1%H?O?(用雙蒸水稀釋),每孔150μL,37℃孵育15min,PBST洗2次。8.3.1.7將辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(酶標(biāo)二抗)用細胞培養(yǎng)液稀釋到工作濃度，每孔100μL,8.3.1.8加入底物(見B.15),每孔100μL,37℃,避光反應(yīng)10min～30min,當(dāng)陽性對照出現(xiàn)明顯藍色，陰性對照無色時加入終止液每孔150pL,用酶標(biāo)儀測量各孔在450nm波長時的光密度值(OD??05GB/T39920—2021以空白對照的OD?so值為零點，先計算陽性對照和陰性對照的OD?50值之比。如果陽性對照孔的OD??0值(P)與陰性對照孔的OD??0值(N)之比大于或等于2.1(即P/N≥2.1),表明對照成立。再計算待測樣品孔與陰性對照孔的OD?so值之比。當(dāng)樣品孔的OD5o值(P)與陰性對照孔ODso值(N)之比大9綜合判定6(資料性附錄)蛙病毒感染概述A.1病原“蛙病毒感染”中的蛙病毒是指虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬(Ranavirus)中感染兩棲類動物的成員。蛙病毒是大型的雙鏈DNA病毒，病毒粒子直徑為150nm～170nm,二十面體對稱，基因組大小為105kb～140kb。A.2癥狀與流行兩棲類動物感染蛙病毒后的癥狀表現(xiàn)為：慢性潰瘍綜合征和急性出血綜合征?；疾∮左w的足底表面皮下組織、腹股溝處以及腹部出現(xiàn)小面積的多灶性出血，伴有腹部水腫，在皮膚上可能形成蒼白病灶。平衡失調(diào)。兩棲類所有成員均易感，自然條件下蛙病毒主要感染有尾目和無尾目的大多數(shù)成員。蛙病毒感染可通過動物間相互接觸、食入感染、瀕死和死亡個體而傳播，也可通過水源及其他途徑進行傳播，包括活魚運輸或魚餌等，流行范圍廣泛。20世紀(jì)60年代，首次在牛蛙(Ranacatesbeima)蝌蚪期分離到蛙病毒，隨后大量蛙病毒從暴發(fā)性疾病中被分離出。據(jù)報道，自1991年開始，已有約80種蛙病毒感染兩棲類和爬行類動物并致病，蛙病毒感染是導(dǎo)致兩棲類動物大量死亡的重要原因。A.3診斷兩棲類動物突發(fā)大量死亡，并伴有皮膚潰瘍和/或遠端肢體壞死等慢性病癥狀，初步提示有蛙病毒感染。用病毒分離、PCR或ELISA方法檢測確診。7(規(guī)范性附錄)B.1細胞培養(yǎng)液使用M199培養(yǎng)基(含Earle's鹽),按說明書的要求，用一級水配制，然后加入10%經(jīng)56℃30min滅活的胎牛血清，用NaHCO?粉末調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH為7.2～7.4。過濾除菌，分裝后-20℃保存。在開放系統(tǒng)使用時，如96孔細胞培養(yǎng)板，需要加入過濾除菌的HEPES,使其在培養(yǎng)液中的終濃度為B.2細胞消化液(EDTA0.02%、胰酶0.06%的PBS緩沖液)NaClKH?PO?Na?HPO4·12H?OEDTA胰酶0.22.30.2加入NaHCO?(大約0.4g～0.6ggggggg),調(diào)節(jié)pH至7.4～8.0(pH<7.4時EDTA難溶),充分?jǐn)嚢柚敝翢o不溶物為止。過濾除菌，分裝后—20℃保存。NaCl8.19gEDTA0.744g容至100mL。使用前加巰基乙醇至終濃度為0.25%。B.4抽提液Ilmol/LTris飽和酚：氯仿：異戊醇=25:24:1混合，密閉避光保存。B.5抽提液Ⅱ?qū)⒙确潞彤愇齑及?4:1的比例混合，密閉避光保存。B.650×電泳緩沖液8GB/T39920—2021Na?EDTA·2H?O37.2g冰乙酸加水定容至室溫貯存。50×電泳緩沖液加水定容至室溫貯存。B.8溴化乙錠(EB)用水配制成10mg/mLB.96×上樣緩沖液溴酚藍B.10包被液(pH9.6)Na?CO?NaHCO?水2.93gNaClNa?HPO?·12H?OKH?PO?KCl水B.12洗滌液PBST0.01molTween-209B.13TMB儲存液DMF(N,N-Dimethylformamide5mL/瓶)B.14底物緩沖液(pH5.0檸檬酸-磷酸緩沖液)檸檬酸(C?H?O?·H?O)Na?HPO?·12H?O蒸餾水B.15底物(用時新鮮配制)底物緩沖液TMB儲存液GB/T39920—2021250mgGB/T39920—2021(資料性附錄)lCGCAGTCAAGGCCTTGATGTTTATGGTGCAGAACGTCACACACCCTTCCGTCGGCTCCAA61TTACACCTGCGTCACTCCCGTCGTGGGAGTCGGCAACACGGTCCTGGAGCCAGCCCTTGC121GGTAGATCCCGTCAAGAGCGCCAGCCTGGTGTACGAAAACACCACAAGGCTCCCCGACAT181GGGAGTCGAGTACTACTCGCTGGTGGAGCCCTGGTACTATGCCACCTCCATCCCAGTCAG241CACCGGGCACCACCTCTACTCTTATGCCCTCAGCCTGCAGGACCCCCACCCATCCGGATC301CACCAATTACGGTAGACTGACCAACGCCAGCCTTAACGTCACCCTGTCCGCTGAGGCCA