漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類抗生素測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

DB32/TXXXX—2020漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類抗生素測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法范圍本標準規(guī)定了漁業(yè)養(yǎng)殖用水中16種喹諾酮類抗生素殘留量的前處理和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本標準適用于漁業(yè)養(yǎng)殖用水中恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、依諾沙星、洛美沙星、萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、丹諾沙星、雙氟沙星、奧比沙星、司帕沙星、氟羅沙星16種抗生素殘留量的測定。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3原理水樣用混合纖維素濾膜過濾后，喹諾酮類抗生素經(jīng)固相萃取柱富集、洗脫和凈化后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量。4試劑和材料4.1甲醇（CH3OH）。4.2乙腈（CH3CN）。甲酸（HCOOH）。乙酸銨（CH3COONH4）。氨水（NH3·H2O）：優(yōu)級純。4.65mmol/L乙酸銨緩沖液：稱取0.1925g乙酸銨（4.4），溶于500mL水中。用甲酸（4.3）調(diào)節(jié)pH為3±0.05。4.75%氨水甲醇溶液：量取5mL氨水（4.5），用甲醇稀釋并定容至100mL。0.1%甲酸水溶液：量取1

mL甲酸（4.3），用水稀釋至1000mL。4.90.1%甲酸水-乙腈：（9+1，體積比），量取90mL0.1%甲酸水溶液（4.8）和10mL乙腈（4.2）混合。4.10標準物質(zhì)：恩諾沙星（Enrofloxacin）、諾氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依諾沙星（Enoxacin）、洛美沙星（Lomefloxacin）、萘啶酸（Nalidixicacid）、惡喹酸（Oxolinicacid）、氟甲喹（Flumequine）、丹諾沙星（Danafloxacin）、雙氟沙星（Difloxacin）、奧比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、氟羅沙星（Fleroxacin），純度≥97.0%。4.11內(nèi)標物質(zhì)：氘代諾氟沙星，氘代環(huán)丙沙星、氘代恩諾沙星，純度≥97.0%。4.12喹諾酮類標準儲備溶液：分別稱取適量喹諾酮類標準品（4.10），用甲醇(4.1)溶解并定容至10

mL，使各種喹諾酮的濃度均為1.0mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6個月。4.13內(nèi)標標準儲備溶液：分別稱取適量內(nèi)標標準品（4.11），用甲醇(4.1)溶解并定容至10

mL，使各種內(nèi)標濃度均為1.0mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6個月。4.14混合標準中間溶液：分別量取適量標準儲備溶液(4.12)于100

mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋配制成濃度為1μg/mL的混合標準中間溶液。-18℃以下避光保存，有效期3個月。4.15混合標準工作溶液：根據(jù)需要用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）由混合標準中間液（4.14）稀釋成合適的混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。4.16混合內(nèi)標標準工作溶液：分別量取適量標準儲備溶液(4.13)于100

mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋配制成濃度為1μg/mL的混合內(nèi)標標準工作溶液。-18℃以下避光保存，有效期3個月。注：除另有說明外，以下所用的試劑均為色譜純，試驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5儀器和設(shè)備5.1液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)。5.2天平：感量0.01g。5.3分析天平：感量0.00001g。5.4渦旋混合器。5.5氮吹儀。5.6pH計：測量精度±0.05。5.7刻度玻璃離心管：10mL。5.8混合纖維素濾膜：0.45μm。5.9水系濾膜：0.22μm。5.10固相萃取柱：HLB固相萃取柱：500mg，6mL，或性能相當者。5.11固相萃取裝置。6樣品制備與保存采集的漁業(yè)養(yǎng)殖水樣經(jīng)0.45μm混合纖維素濾膜過濾。如水樣較渾濁，可更換濾膜或過濾2次。過濾后的水樣于4℃密封保存，24h內(nèi)進行檢測?！∵^濾后的供試樣品，作為供試試料?！∵^濾后的空白樣品，作為空白試料?！∵^濾后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試料。7測定步驟7.1提取和凈化依次用6mL甲醇，6mL超純水，6mL5mmol/L乙酸銨緩沖液（4.6）活化小柱（5.10）。量取200mL過濾后的試樣，加入適量甲酸調(diào)節(jié)水樣pH為3.0±0.05，準確加入1μg/mL混合內(nèi)標標準工作液50μL（4.16）。然后以約3~5mL/min流速通過固相萃取柱（5.10）。過柱后用6mL超純水淋洗，再將小柱于氮氣保護下干燥20min，最后用6mL5%氨水甲醇溶液（4.7）分兩次進行洗脫。洗脫液于40℃水浴用氮氣吹至近干，用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）定容至1mL，渦旋混勻1min，過0.22μm水系濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。7.2標準曲線的制備精確量取適量混合標準中間溶液(4.14)和適量1μg/mL混合內(nèi)標標準工作液（4.16），用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）配制成同位素內(nèi)標濃度為50ng/mL以及16種喹諾酮濃度為1、5、10、20、50、100和200ng/mL系列標準溶液。以被測組分和相應(yīng)內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。7.3測定7.3.1色譜參考條件液相色譜參考條件如下：色譜柱：EC-C18柱，(2.1mmx100mm，2.7μm)，或性能相當者。流速：0.40mL/min。柱溫：30℃。進樣量：10μL。A為0.1%甲酸水溶液(4.8)，B為乙腈(4.2)；梯度洗脫程序見表1。表1流動相梯度洗脫程序時間/minA相/%B相/%0.009552.00851510.00455512.00109013.0095515.00955質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：離子化模式：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；噴霧電壓：5500v；氣簾氣流量：2

L/min；霧化氣流量：8L/min；輔助加熱氣流量：8L/min；離子源溫度：500℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，掃描參數(shù)見附錄A；定性測定在同樣測試條件下，試樣溶液中各抗生素的保留時間與標準物質(zhì)保留時間相對偏差在±2.5%以內(nèi)，且檢測到的定性離子的相對豐度，應(yīng)與濃度相當?shù)臉藴嗜芤褐卸ㄐ噪x子的相對豐度一致?；迮c次強碎片離子豐度比應(yīng)符合表2要求。各抗生素的保留時間參考附錄B。表2基峰與次強碎片離子豐度比要求次強碎片離子相對豐度%＞50＞20～50＞10～20≤10允許相對偏差%±20±25±30±507.3.4定量測定將標準工作液和試樣溶液等體積進樣測定，按內(nèi)標法進行定量分析，在樣品中加入回收率指示物，以此來保證整個樣品前處理過程的回收率。諾氟沙星、依諾沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標，環(huán)丙沙星、洛美沙星以氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標，恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、丹諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、雙氟沙星、惡喹酸、氟甲喹、萘啶酸、氟羅沙星、奧比沙星以氘代恩諾沙星為內(nèi)標。7.3.5空白試驗除不加試樣外，均按上述測定條件和步驟進行。8結(jié)果計算試樣中喹諾酮類抗生素含量按公式(1)計算，計算結(jié)果需扣除空白值，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。………（1）式中：Xi—試樣中喹諾酮類抗生素含量，單位為納克每升(ng/L)；ci—試樣溶液中喹諾酮類抗生素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；V1—試樣溶液最終體積，單位為毫升(mL)；m—試樣體積，單位為升(L)。9方法靈敏度、準確度和精密度靈敏度本方法的定量限為10ng/L。準確度本方法回收率范圍為70%～120%。精密度本方法的批內(nèi)變異系數(shù)≤15%，批間變異系數(shù)≤15%。附錄A（資料性附錄）掃描參數(shù)表A.116種喹諾酮類抗生素及內(nèi)標物的母離子、子離子和碰撞能量序號化合物母離子/(m/z)子離子/(m/z)碰撞能量/V1恩諾沙星36024538316*262諾氟沙星32023335276*263培氟沙星33429027316*304環(huán)丙沙星33224532288*265氧氟沙星36226126318*386沙拉沙星38629936342*267依諾沙星32123244303*308洛美沙星35226533308*289萘啶酸233.3215.228187.4*4410惡喹酸26221639244*2611氟甲喹26220225244*4012丹諾沙星35828330340*2413雙氟沙星40029938356*3014奧比沙星39629535352*2615司帕沙星39329235349*2716氟羅沙星37026937326*2717氘代諾氟沙星3253073018氘代環(huán)丙沙星3403222819氘代恩諾沙星36532129注：*為定量離子附錄B（資料性附錄）標準溶液液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖和參考保留時間圖B.116種喹諾酮標準工作溶液液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜XIC色譜圖圖B.216種喹諾酮標準工作溶液液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜TIC色譜圖