DB53-T 1229-2024 暗褐脈柄牛肝菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSB0553IDB53/T1229—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由景洪宏臻農(nóng)業(yè)科技有限公司提出。本文件由云南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（YNTC07）歸口。本文件起草單位：景洪宏臻農(nóng)業(yè)科技有限公司。本文件主要起草人：紀(jì)開萍、曹旸、紀(jì)光燕、王秋蘭、羅順珍、高麗霞、紀(jì)光玉、晏汐蓓、陶玲。1DB53/T1229—2024暗褐脈柄牛肝菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了暗褐脈柄牛肝菌（Phlebopusportentosus（Berk.&Broome）Boedijn）菌種的生產(chǎn)條件、工藝流程、母種制備、藥瓶液體菌種制備、發(fā)酵罐液體菌種制備、栽培種制備、記錄與檔案、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸。本文件適用于暗褐脈柄牛肝菌菌種生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4806.7食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸用塑料材料及制品GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB14881食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品生產(chǎn)通用衛(wèi)生規(guī)范GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程DB53/T491暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1暗褐脈柄牛肝菌phlebopusportentosus又名暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，拉丁文學(xué)名Phlebopusportentosus(Berk.&Broome)Boedijn，商品名黑牛肝菌，隸屬于牛肝菌目Boletales、小牛肝菌科Boletinellaceae、脈柄牛肝菌屬Phlebopus。3.2暗褐脈柄牛肝菌菌種phlebopusportentosusspawn暗褐脈柄牛肝菌菌絲體及其生長(zhǎng)基質(zhì)組成的液體和（或）固體繁殖材料，包括母種、搖瓶液體菌種、發(fā)酵罐液體菌種、栽培種。3.3母種stockculture經(jīng)組織分離、菌種選育等方式獲得的，以玻璃試管或培養(yǎng)皿為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)液添加瓊脂制成的固體培養(yǎng)基，具有結(jié)實(shí)性的菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物。3.4搖瓶液體菌種conicalflaskliquidspawn由母種擴(kuò)繁而得的，以搖瓶為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)液，具有結(jié)實(shí)性的菌絲體純培養(yǎng)物。3.5發(fā)酵罐液體菌種fermenterliquidspawn2DB53/T1229—2024由搖瓶液體菌種擴(kuò)繁而得的，以發(fā)酵罐為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)液，具有結(jié)實(shí)性的菌絲體純培養(yǎng)物。3.6栽培種cultivatedspawn由母種、搖瓶液體菌種或發(fā)酵罐液體菌種等擴(kuò)繁而得的，以一定容量的瓶子或袋子為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基質(zhì)為富含木質(zhì)纖維素或谷物粒等天然有機(jī)物添加營(yíng)養(yǎng)液，具有結(jié)實(shí)性的菌絲體純培養(yǎng)物。4生產(chǎn)條件4.1人員人員應(yīng)符合GB14881中的相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)后，掌握暗褐脈柄牛肝菌基礎(chǔ)知識(shí)及暗褐脈柄牛肝菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程。4.2生產(chǎn)環(huán)境生產(chǎn)環(huán)境應(yīng)符合NY/T528中的相關(guān)要求。4.3設(shè)施4.3.1主要設(shè)施主要設(shè)施包括原材料堆場(chǎng)、原材料庫、培養(yǎng)基配制室、滅菌室、搖瓶接種室、搖瓶培養(yǎng)室、發(fā)酵罐配料室、發(fā)酵罐冷卻室、發(fā)酵罐接種室、發(fā)酵罐培養(yǎng)室、栽培種冷卻室、栽培種接種室、栽培種培養(yǎng)室、化驗(yàn)室等。4.3.2設(shè)施要求設(shè)施應(yīng)符合以下要求：a)地面應(yīng)能防水、防腐蝕、防滲漏、防滑，易清洗，有適當(dāng)?shù)呐潘露龋?.0%～1.5%）和良好的排水系統(tǒng)，排水溝應(yīng)是圓弧式的明溝；b)墻壁和天花板應(yīng)能防潮、防霉、防水、易清洗；c)門窗應(yīng)設(shè)置防蚊蠅紗網(wǎng)；d)入口處應(yīng)設(shè)置洗手、消毒和干手、風(fēng)淋等潔凈設(shè)施，并設(shè)置二次更衣；e)設(shè)置有排氣管道；f)設(shè)置與職工人數(shù)相適應(yīng)的更衣室、浴室、廁所和工作休息室；g)凈化操作區(qū)域應(yīng)符合GB50073中的相關(guān)要求；h)搖瓶接種室、搖瓶培養(yǎng)室、發(fā)酵罐配料室、發(fā)酵罐冷卻室、發(fā)酵罐接種室、發(fā)酵罐培養(yǎng)室、栽培種冷卻室、栽培種接種室、栽培種培養(yǎng)室為萬級(jí)無菌凈化操作區(qū)域；i)開蓋接種重點(diǎn)區(qū)域局部達(dá)到無菌級(jí)百級(jí)。4.4設(shè)備4.4.1生產(chǎn)設(shè)備包括但不限于發(fā)電設(shè)備、調(diào)溫設(shè)備、空氣壓縮機(jī)、空氣過濾器、高壓蒸汽滅菌鍋、攪拌機(jī)、裝瓶設(shè)備、超凈工作臺(tái)、恒溫回旋式振蕩器、液體菌種發(fā)酵罐、接種設(shè)備等。4.4.2檢驗(yàn)設(shè)備3DB53/T1229—2024恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡、磁力攪拌機(jī)、電子天平、pH計(jì)等。4.5器具4.5.1玻璃三角瓶容量500mL～1000mL，耐126℃高溫，無色或近無色，配備硅膠塞。4.5.2聚丙烯塑料瓶符合GB4806.7的規(guī)定，容量1400mL～1600mL，可耐受126℃,無色或近無色，瓶口直徑6cm~9cm，瓶蓋應(yīng)預(yù)留通氣孔，并可夾墊海綿片或無紡布以防止培養(yǎng)期的污染。4.5.3其他培養(yǎng)皿、接種鏟/針、打孔器、試管、量杯、容量瓶、玻璃漏斗、定量定性濾紙等。5工藝流程工藝流程為：母種—接種搖瓶培養(yǎng)—搖瓶液體菌種—接種發(fā)酵罐培養(yǎng)—發(fā)酵罐液體菌種—接種栽培瓶培養(yǎng)—栽培種。6母種制備6.1母種制備應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。6.2母種質(zhì)量要求應(yīng)符合DB53/T491中的規(guī)定。6.3母種培養(yǎng)基配方可參照附錄A。7搖瓶液體菌種制備7.1培養(yǎng)基配制與分裝培養(yǎng)基配參見附錄A。用水符合GB5749要求，以4.5.1中的玻璃三角瓶分裝培養(yǎng)基，裝液量不超過三角瓶容量的60%。7.2滅菌滅菌溫度121℃,滅菌時(shí)間30min。滅菌完畢后，應(yīng)自然降壓，不允許強(qiáng)制降壓。7.3冷卻將滅菌后的液體培養(yǎng)基放入搖瓶接種室內(nèi)超凈工作臺(tái)中進(jìn)行冷卻，冷卻至20℃~25℃。7.4接種在超凈工作臺(tái)上，使用打孔器和接種鏟/針，按無菌操作要求接種。每瓶接2～3塊，直徑6mm～8mm瓊脂培養(yǎng)基的母種菌塊。7.5培養(yǎng)7.5.1培養(yǎng)室準(zhǔn)備4DB53/T1229—2024培養(yǎng)室使用的前兩天，宜用臭氧發(fā)生器消毒。恒溫回旋式振蕩器以1.8g/L～2.2g/L新潔爾滅或75%酒精進(jìn)行擦拭消毒。7.5.2培養(yǎng)方法接種后，置于恒溫回旋式振蕩器培養(yǎng)6d～7d，振蕩頻率150r/min～180r/min，培養(yǎng)溫度26℃~29℃為宜。7.6檢查培養(yǎng)期間每天檢查，及時(shí)去除污染或異常的菌種，并應(yīng)留樣用于檢驗(yàn)。7.7質(zhì)量要求培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，搖瓶液體菌種應(yīng)達(dá)到表1中的技術(shù)指標(biāo)及表2中的理化指標(biāo)。表1搖瓶液體菌種技術(shù)指標(biāo)菌絲體球狀，呈淡黃色，菌球大小均勻，形狀規(guī)則有類似于暗褐脈柄牛肝菌菇體的的芳香氣味，無異表2搖瓶液體菌種理化指標(biāo)終止pH值8發(fā)酵罐液體菌種制備8.1投料前準(zhǔn)備檢查罐上全部閥門、安全閥、壓力表，要求完好，工作正常。對(duì)罐體內(nèi)、外和全部閥門用流水進(jìn)行沖洗，內(nèi)壁無任何培養(yǎng)料殘余物、清潔無死角。8.2培養(yǎng)基制備參照附錄A中的培養(yǎng)基配方進(jìn)行配制。用水應(yīng)符合GB5749要求。8.3投料定容8.3.1將原材料分別用水溶解，倒入或用泵抽入發(fā)酵罐中。8.3.2加水定容至所需體積，培養(yǎng)基投料量不超過罐體總?cè)莘e的70%。8.3.3清理加料口，不應(yīng)有殘留的物料，擰緊上料口蓋。5DB53/T1229—20248.4發(fā)酵罐實(shí)消對(duì)投料后的發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，蒸汽壓力0.105MPa～0.125MPa，溫度121℃~124℃,保持20min～40min。8.5冷卻、調(diào)壓8.5.1滅菌結(jié)束，將發(fā)酵罐移至冷卻室，通入無菌空氣，開啟冷水閥門采用水淋降溫，冷卻水通過下水道排出。8.5.2待溫度降至26℃,關(guān)閉冷水閥門，調(diào)整排氣口與無菌空氣進(jìn)氣閥門，使罐內(nèi)壓力維持在0.03MPa。8.6接種按下列步驟完成接種：a)發(fā)酵罐接種口底部以95%酒精點(diǎn)燃火焰圈，灼燒3min；b)調(diào)節(jié)排氣閥，使罐內(nèi)壓力降至0.01MPa；c)打開發(fā)酵罐接種口蓋，在火焰上打開搖瓶液體菌種，灼燒瓶口后倒入發(fā)酵罐中,接種量為1︰600（v/v）；d)用火焰灼燒接種口蓋后迅速擰緊，移走火焰圈，調(diào)整罐壓保持在0.03MPa。8.7培養(yǎng)接種完畢，立即進(jìn)入培養(yǎng)階段，應(yīng)滿足下列條件：a)罐內(nèi)換氣量1︰0.5～1.2（v／v，料液體積／空氣體積)；b)罐壓保持在0.02MPa～0.05MPa；c)培養(yǎng)溫度26℃~29℃;d)機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐所使用的磁力攪拌頻率為20Hz；e)培養(yǎng)4d～6d時(shí)，觀測(cè)其培養(yǎng)狀況，達(dá)到表3中的技術(shù)指標(biāo)，及表4中的理化指標(biāo)，即可終止。表3發(fā)酵罐液體菌種技術(shù)指標(biāo)有類似于暗褐脈柄牛肝菌菇體的的芳香氣味，無異表4發(fā)酵罐液體菌種理化指標(biāo)終止pH值6DB53/T1229—20249栽培種制備9.1培養(yǎng)基制備參照附錄A中的培養(yǎng)基配方進(jìn)行配制，用水應(yīng)符合GB5749要求。9.2裝瓶以4.5.2中的聚丙烯塑料瓶分裝培養(yǎng)基，裝瓶量為每瓶濕重1000g～1080g，料面距瓶口2cm～3cm，中間打4個(gè)孔。9.3滅菌滅菌溫度123℃,滅菌時(shí)間100min。滅菌完畢后，應(yīng)自然降壓。9.4冷卻滅菌后的菌種瓶放入冷卻室冷卻至16℃~20℃。9.5接種在無菌級(jí)百級(jí)區(qū)域內(nèi)，使用無菌管道在0.15MPa壓力下，將發(fā)酵罐液體菌種注射接種到菌種瓶中，每瓶接入液體菌種25ml～30ml。接種完成后，應(yīng)寫明接種日期、批次，送入培養(yǎng)室。9.6培養(yǎng)避光培養(yǎng)。溫度26℃~29℃,CO2濃度控制在1500ppm～2000ppm、相對(duì)空氣濕度60%～70%，培養(yǎng)28d～30d，菌絲長(zhǎng)滿。9.7檢查在培養(yǎng)期間，每天抽樣開蓋觀察菌種萌發(fā)、生長(zhǎng)情況，并由菌瓶外壁觀察菌絲生長(zhǎng)情況，對(duì)生長(zhǎng)異常的菌瓶開蓋檢查，及時(shí)去除污染或異常的菌種，并應(yīng)及時(shí)留樣用于檢驗(yàn)。9.8質(zhì)量要求應(yīng)符合DB53/T491的規(guī)定。10記錄與檔案生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)填寫生產(chǎn)記錄，生產(chǎn)記錄表參見附錄B。由具體操作人員現(xiàn)場(chǎng)記錄填寫，由技術(shù)負(fù)責(zé)人審核，簽字后歸檔，檔案保存至少2年。11標(biāo)簽、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存標(biāo)簽、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存應(yīng)符合DB53/T491的規(guī)定。7DB53/T1229—2024暗褐脈柄牛肝菌菌種生產(chǎn)培養(yǎng)基配方A.1母種培養(yǎng)基配方蔗糖20g、磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂1g、馬鈴薯200g（切片煮汁）、瓊脂粉10g～15g、定容至1L，pH值自然。A.2搖瓶液體菌種培養(yǎng)基配方A.2.1馬鈴薯200g（切片煮汁）、酵母膏2g、葡萄糖20g，定容至1L，pH值自然。A.2.2蔗糖20g、磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂1g、馬鈴薯200g（切片煮汁）、豆粕粉（過100目篩，篩孔直徑0.15mm）2g、定容至1L，pH值自然。A.2.3馬鈴薯200g（切片煮汁）、麥麩2g、蔗糖20g、硫酸亞鐵1g、定容至1L，pH值自然。A.3發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)基配方A.3.1馬鈴薯淀粉1.5g/L、糖蜜2g/L、硫酸鎂0.5g/L、酵母膏2g/L、氯化鉀1g/L、消泡劑0.25g/L，pH值4～6。A.3.2馬鈴薯100g/L（切片煮汁）、蔗糖1.5g/L、麥麩2g/L、維生素C為50mg/L、硫酸鎂1g/L、磷酸二氫鉀1g/L、消泡劑0.25g/L，pH值4～6。A.4栽培種培養(yǎng)基配方A.4.1按質(zhì)量占比木屑20%、谷粒4%、蔗渣8%、紅壤土8%、硫酸鎂0.04%、磷酸二氫鉀0.04%、酵母膏0.04%、含水量60%，pH值自然。