流式細胞儀培訓手冊(完成版)

流式細胞儀培訓手冊序論學習儀器的最好方法是操作儀器，然而在理解原理的根底上進行儀器操作無疑會起到事半功倍的作用。本書介紹了流式細胞儀的根本知識，并從不同角度詳盡闡述了各種臺式機〔FACScanTM，F(xiàn)ACSortTM，F(xiàn)ACSCaliburTM，和BDLSR〕與大型機〔FACSVantageTM，F(xiàn)ACSVantageTMSE，和FACStarPLUSTM〕之間的不同。閱讀本書有助于增強讀者操作儀器的動手能力和經(jīng)驗。目錄第1章綜述……………………4第2章液流系統(tǒng)………………第3章散射光信號及熒光信號………………3.1散射光信號………3.2熒光信號…………3.3熒光補償?shù)?章光電系統(tǒng)………………4.1光平臺……………4.2光學濾片………4.3信號探測器……………………4.4閾值………………第5章數(shù)據(jù)分析………………5.1數(shù)據(jù)采集及顯示…………………5.2設門………………5.3細胞亞群的數(shù)據(jù)分析…………5.4流式細胞儀其它應用的數(shù)據(jù)分析………………5.5CellQuest軟件使用……………5.6MutiSet軟件使用………………5.7Simultest軟件使用……………5.8B27軟件使用…………………5.9WinMDI軟件使用…………5.10FACSPress軟件使用…………5.11SystemII軟件使用…………5.12MultiCycle軟件使用…………5.13Modfit使件使用……………第6章流式根本檢測工程6.1淋巴細胞亞群檢測〔雙色、三色、四色，三種軟件分析〕6.2B27的檢測………6.3血小板抗體檢測………………6.4網(wǎng)織血小板及紅細胞分析……6.5干細胞檢測……………………6.6DNA倍體分析……………………6.7凋亡檢測…………第7章分選6.1分選………………第8章激光器及光路校正……………………7.1激光器的工作原理………………7.2光路校正…………第9章答案………………第一章綜述流式細胞術是一項快速檢測分析單個粒子多物理特性的高技術，通常指細胞通過激光束時在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以及相對的熒光強度。通過光電系統(tǒng)記錄細胞的散射光信號和熒光信號可得知細胞特性。流式細胞儀主要由三局部組成：流動室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下：·液流系統(tǒng)：依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)?！す饴废到y(tǒng)：細胞由激光激發(fā)，通過光學濾片產(chǎn)生光信號，并傳送到相應的探測器?！る娤到y(tǒng)：把光信號轉(zhuǎn)換為電信號。對于有分選裝置的儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。在流式細胞儀中，細胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。任何存在于懸液中的直徑為0.2-150微米的粒子或細胞都適用于流式分析。在實際工作中，用實體組織進行流式細胞分析往往是不可能的，分析之前必須對其進行分解。被液滴包繞的粒子稱為細胞液柱，當粒子經(jīng)過激光照射區(qū)時，通過激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。含有熒光的粒子就會表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)〔相應的透鏡，濾片和探測器〕收集。分光器和濾光片引導散射光和熒光至相應的探測器，把光信號轉(zhuǎn)換為電信號。單個粒子通過其表現(xiàn)出的光散射和熒光屬性，通過列表模式〔Listmode〕完成數(shù)據(jù)采集，并對樣本中的細胞亞群進行分析。圖1-1散射光和激發(fā)光信號轉(zhuǎn)換成為計算機可處理的充電脈沖習題：概覽1流式細胞儀可測量細胞或粒子的哪些屬性？2大多數(shù)流式細胞儀使用何種光源？3流式細胞儀的三大系統(tǒng)是什么？4哪種類型的生物樣本最適于做流式細胞分析？5液流包繞細胞形成？6帶有熒光的細胞通過激光束時，會產(chǎn)生哪兩種光信號？7由粒子激發(fā)的光由收集。8所有流式細胞測量是在單個細胞上同時進行嗎？〔對錯〕9在進行流式分析之前粒子必須是單個細胞懸液嗎？〔對錯〕第二章液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細胞傳送到激光束的中心。而且在特定時間內(nèi)，應該只有一個細胞或粒子通過激光束。因此，必須在流動室內(nèi)把細胞注入鞘液流。流動室是液流系統(tǒng)的核心部件，臺式機中流動室稱為樣品槽，大型機稱之為噴嘴。在流動室內(nèi)細胞液柱聚焦于鞘液中心，細胞在此與激光相交。流動室內(nèi)充滿鞘液，根據(jù)層流原理，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液柱。這種同軸流動的設計，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種分層鞘流的狀態(tài)，這個過程稱為流體聚焦。該原理適用于所有流動室，如圖2-1和2-2所示：圖2-1細胞液柱通過樣品槽產(chǎn)生流體聚焦，圖2-2細胞液柱通過噴嘴產(chǎn)生流體聚焦樣本壓力和鞘液壓力是不同的，且樣本壓力總是大于鞘液壓力。樣本壓力調(diào)節(jié)器通過改變樣本壓力的方法控制樣本流速?！づ_式機：單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出，粒子或細胞在流動室內(nèi)與激光相交〔圖2-1〕。除BDLSR型臺式機有樣本壓力細調(diào)旋鈕外，大多數(shù)臺式機都采用固定的樣本壓力〔分低，中，高速〕?！ご笮蜋C：單個細胞懸液從噴嘴噴出后，粒子或細胞在流動室外與激光相交〔圖2-2〕。且樣本壓力連續(xù)可調(diào)。增加樣本壓力就是通過加寬液柱的方法增加樣本流速。換言之，在特定時間內(nèi)，允許更多細胞通過液流。當液柱變寬時，一些流經(jīng)激光束的細胞會偏離中心，光斑也會偏離理想角度，這在一定程度下是允許的?！じ吡魉龠m用于定性測量，如免疫表型。樣本流變寬，細胞間距離縮短，這樣在單位時間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)?！さ土魉俅偈箻颖玖髯冋?，單個細胞得以依次通過，這樣大多數(shù)細胞可流經(jīng)激光束的中心，細胞受激光照射的能量比擬均一，因而低流速適用于檢測分辨率要求高的實驗，如DNA分析。為確保粒子和細胞完全通過激光束，正確調(diào)節(jié)樣本壓力對實驗操作是至關重要的。習題：液流系統(tǒng)1流式細胞儀中液流系統(tǒng)的作用是什么？2細胞流經(jīng)激光束時影響激光照射細胞的兩個因素是什么？3在特定時間內(nèi)，應該有多少細胞流過激光束？4單個細胞懸液在內(nèi)注入。5鞘液環(huán)包樣品并使之居中的過程稱為效應。6什么調(diào)節(jié)器可以控制細胞液柱的寬窄？7對于臺式機，樣本的固定壓力是多少。8增加樣本壓力，也就是樣本流速和液柱。9DNA研究對檢測分辨率要求較高，推薦流速為多少。10加大流速會降低檢測分辨率?！矊﹀e〕11定性檢測時可使用高流速?！矊﹀e〕第三章散射光信號和熒光信號的檢測上一章我們了解到粒子或細胞是如何依次通過液柱的，本節(jié)我們首先學習激光如何照射在單個細胞上的。3.1散射光信號粒子折射激光產(chǎn)生散射光信號。散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術〔如染色〕，因此被稱為細胞的物理特性，即細胞的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。散射光與細胞膜，核膜以及細胞結(jié)構(gòu)的折射性、顆粒性密切相關，細胞形狀和外表形貌也對其產(chǎn)生影響。前向角散射：前向角散射〔FSC〕光與被測細胞的大小和面積有關，檢測的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向的散射光信號〔見圖3-1〕。FSC不受細胞熒光染色的影響，常用于免疫表型分析的信號處理。側(cè)向角散射：側(cè)向角散射〔SSC〕光與被測細胞的顆粒密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關，對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感〔見圖3-1〕。SSC收集與激光束正交90度方向的散射光信號。圖3-1細胞的光散射特性上述兩種信號都是來自于激光原光束，目前采用這兩個參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類的細胞亞群，同時可獲得細胞相關的重要信息，下列圖〔圖3-2〕為FSC和SSC組成的二維散點圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細胞、單核細胞及粒細胞區(qū)分開。圖3-2FSC、SSC二維散點圖習題：散射光信號1什么時候會發(fā)生光散射現(xiàn)象。2光散射信號與細胞的哪些特性有關。3與激光束方向相同的光散射稱為散射。4FSC與細胞的哪些特性相關？5與激光束方向呈90度角的光散射稱為散射。6SSC與細胞的和相關。7和雙參數(shù)的組合可區(qū)分不同種類的細胞亞群。3.2熒光信號熒光物質(zhì)吸收符合其波長范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過剩能量成為光子。這種能量的轉(zhuǎn)換稱為熒光。能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長范圍稱為激發(fā)光譜。因為更多的能量消耗在吸收轉(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長要高于激發(fā)光波長。熒光物質(zhì)的發(fā)射波長范圍叫做發(fā)射光譜。目前的流式細胞儀大多采用氬離子激光器，因為488nm的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光〔詳見第7章〕。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號愈強。FITC的激發(fā)光譜如圖3-3所示，488nm非常接近FITC的激發(fā)光譜的峰值，所以FITC被激發(fā)時會表現(xiàn)出最強熒光信號，而當FITC被其波譜范圍內(nèi)的其它波長激發(fā)時，也會檢測到熒光，但信號強度不會這么高。圖3-3FITC、PE、PerCP、APC染料的激發(fā)光譜如果激發(fā)光波長都是488nm，而發(fā)射光波長又不是極其接近的話，我們可以同時檢測兩種以上的熒光。如FITC和PE雙染就符合這種條件。這兩種熒光素的發(fā)射光譜如圖3-4所示。雖然PE的激發(fā)光譜的峰值不是488nm，但也足以檢測到熒光。更重要的是，F(xiàn)ITC的發(fā)射光波長是530nm，PE的發(fā)射光波長是570nm。他們的發(fā)射光波長足夠遠，可以使用不同的檢測器。被檢測到的熒光信號數(shù)量與粒子中標記上的分子數(shù)量成正比。圖3-4FITC、PE、PerCP、APC染料的發(fā)射光譜圖3-5熒光標記抗體對細胞外表抗原的特異性結(jié)合對單克隆抗體進行熒光染色，通過分析細胞外表抗原標記確認細胞類型〔見圖3-5〕。在細胞的混合群體中，我們使用不同的熒光染料區(qū)分細胞亞群。每個亞群的染色模式與FSC和SSC數(shù)據(jù)相結(jié)合，用于識別樣本中的細胞種類，并可以得到各細胞亞群的百分含量。而且，還可以對感興趣的細胞進行再分選。3.3熒光補償使用流式細胞儀進行多色分析時，由于熒光發(fā)射光譜的重疊，需要做補償調(diào)整 在流式細胞儀上進行多色免疫熒光分析時，使用的不同熒光素的發(fā)射光譜有重疊現(xiàn)象，如果不對這種現(xiàn)象做適當?shù)恼{(diào)整，就會導致某一熒光素發(fā)出的熒光被其它“錯誤”的檢測器檢測到。這種由于補償問題導致的錯誤，會得到假陽性的錯誤結(jié)果，并可能在等高圖的多色分析時，得到錯誤的細胞群體。這里，我們可以通過使用恰當?shù)膯稳净螂p染的樣本，對補償加以調(diào)整，去除光譜重疊局部的影響信號，就可以準確地在流式細胞儀上進行細胞多色分析了。單克隆抗體偶聯(lián)上熒光素fluoresceinisothiocyanate〔FITC〕、R-phychoerythrin〔R-PE〕以及Cy-Chrome，就可以用來檢測某一細胞群的多種抗原特性了。在做這樣的多色分析時，使用同一波長的激發(fā)光〔488nm〕，即15毫瓦氬離子激光。FITC的發(fā)射光為綠色熒光〔峰值為530nm〕，信號被FL1檢測器檢測；R-PE的發(fā)射光為橙紅色熒光〔峰值為575nm〕，信號被FL2檢測器檢測；Cy-Chrome的發(fā)射光為紫紅色熒光〔峰值為670nm〕，信號被FL3檢測器檢測。但是，F(xiàn)ITC的發(fā)射光譜有橙紅色光，而R-PE的發(fā)射光譜也有綠色光，等等，依次類推。這些光譜的交叉重疊，會導致熒光信號被相應檢測器以外的錯誤的檢測器探測到。因此，要使用補償?shù)姆椒ㄐＵ@種信號重疊導致的錯誤。它通過電子補償?shù)姆椒?，來去除重疊信號的影響，通過電子補償，使檢測到的單染細胞的另外兩種熒光信號與未染色細胞的信號水平相同。 補償缺乏或補償設置不當，都會導致假陽性結(jié)果或人為造成直方圖的偏移。例如，在多色分析中，如果熒光染色細胞的補償設置缺乏，就可能在雙色等高圖上顯示出一個假的雙陽性群體，導致數(shù)據(jù)分析失誤。在三色熒光分析時，為了防止由于補償造成的錯誤，應該使用單染細胞調(diào)整補償〔另外兩種熒光為陰性對照〕，即用每一個熒光抗體單染細胞，然后調(diào)整每兩種顏色之間的補償。雙色分析時，可以使用兩個互斥的單陽性抗體，通過兩種單陽性細胞群體和雙陰性群體來調(diào)整補償。為了使測定結(jié)果標準化，并到達長期檢測儀器性能的目的，應該每日使用標準熒光微球和自動的定標/補償軟件，做熒光補償?shù)某醪秸{(diào)整。流式細胞儀多色分析的補償調(diào)整步根據(jù)實驗室要求，每日做儀器校正〔calibration/standardization〕。檢測一個未染色樣本〔自發(fā)熒光〕，調(diào)整前向角散射光FSC和側(cè)向角散射光SSC設置，使測定細胞群體顯示好，并可以按要求設門。設門后，調(diào)整自發(fā)熒光的FL1、FL2、FL3的電壓設置〔detectorsettings〕，在對數(shù)模式下，使自發(fā)熒光位于熒光直方圖的左側(cè)〔101以內(nèi)〕。比擬自發(fā)熒光和陽性細胞的熒光強度，保證每個熒光的陽性水平都可以按比例顯示。使用熒光抗體逐個染色〔單染〕，運行單染樣本，調(diào)整補償。監(jiān)測雙色點圖，調(diào)整補償設置〔compensationsettings〕，使染色陽性細胞和未染色陰性細胞在橫軸水平，在縱軸垂直。例如，對于PE標記的單克隆抗體染色的細胞群，上下調(diào)整FL1-%FL2的設置，使FL2陽性群體與FL2陰性群體上下垂直〔FL2vsFL1點圖〕；然后，使用FITC標記的單克隆抗體染色的細胞群，左右調(diào)整FL2-%FL1的設置，使FL1陽性群體與FL1陰性群體左右水平〔FL2vsFL1點圖〕。然后，再依次調(diào)整第三色補償FL2-%FL3和FL3-%FL2。使用雙色補償質(zhì)控樣本，微調(diào)補償。用①FITC和PE單克隆抗體，②PE和Cy-Chrome單克隆抗體染色，最好使用單克隆抗體和同型對照染互斥的單陽性細胞群體。可以將兩種單染細胞混合，用一個樣本管進行雙色補償調(diào)整〔如混合FITC和PE染色細胞〕，在缺少互斥標記的情況下，可以使用此方法。每一種細胞群體應位于相應的象限。在某些流式細胞儀上，F(xiàn)L1和FL3不能直接進行補償。因此，做雙色分析時，不需要做FITC/Cy-Chrome補償對照管。檢查三色熒光染色的細胞群，在前面的步驟里，已經(jīng)做好了補償，因此，這里就不需要再調(diào)整了。獲取樣本的對照管和實驗管，并保存數(shù)據(jù)文件。每一個多色分析的實驗，都需要進行補償?shù)恼{(diào)整。因此，每做一種多色分析的實驗，都要用單染和雙染對照樣本，按照3-7步做實驗條件的調(diào)整。為了減少不同試劑間的熒光條件的調(diào)整，在開始調(diào)整補償時，首先應選擇各熒光通道中染色最強的試劑/細胞。習題：熒光信號1當熒光物質(zhì)吸收激光能量，并釋放過剩能量時，會發(fā)射。2熒光物質(zhì)能被激光激發(fā)出熒光的波長范圍稱為。3由熒光染料發(fā)射的波長稱為。4在流式細胞儀中通常采用什么激光器。5能夠激發(fā)FITC和PE的波長是多少。6流式細胞儀最常用的兩種熒光素是和。7熒光素標記抗體用于檢測。第四章光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)由光學激發(fā)器和光學收集器組成。光學激發(fā)器包括激光和透鏡，透鏡用于形成激光束，并使之聚焦。光學收集器那么由假設干透鏡組成，用于收集粒子發(fā)射的光束激光束相互作用，透鏡組和濾片發(fā)送激光束至相應的光學探測器。光平臺的設計可實現(xiàn)以上功能。4.1光學平臺流式細胞儀的光平臺提供了一個固定平面，將激光源、光學激發(fā)器和收集器控制在一個固定的位置。因而臺式機的流動室和光路是固定的，能夠保證光斑和樣本流自始至終保持恒定。圖4-1和圖4-2分別為臺式機FACSCalibur和BDLSR的光平臺系統(tǒng)。圖4-1臺式機FACSCalibur光平臺系統(tǒng)圖4-2臺式機BDLSR光平臺系統(tǒng)在大型機中，當液流流過噴嘴時，激光束通過消色差透鏡組以最正確角度和位置截取液流。由于光斑和液流位置會發(fā)生變化，所以大型機的光路沒有臺式機穩(wěn)定，需要每日優(yōu)化。光路不正有可能導致粒子受激光照射的能量不均一，從而被激發(fā)出的熒光強度也不相同，造成測量誤差。大型機的光平臺系統(tǒng)見圖4-3。圖4-3大型機FACSVantageSE光平臺系統(tǒng)習題：光學平臺1光平臺為激光器與提供了一個固定平面。2保證所有細胞受到均一的光照強度的兩個必要條件是什么。3每次使用大型機時都需要進行光路校正〔對錯〕。4在臺式機中，固定的能夠保證激光截取的位置是不變的。4.2光學濾片當細胞或粒子流過激光照射區(qū)時，SSC和熒光信號很弱，需要使用光電倍增管〔PMTs〕收集，而FSC信號很強，由光電二極管收集即可。所有信號經(jīng)由透鏡組和濾片組到達相應的檢測器。光電倍增管〔PMTs〕檢測到的熒光信號常常是很微弱的。在光電倍增管〔PMTs〕前設置濾片可以使相當窄的一波長范圍內(nèi)光通過，提高了熒光信號的純度和強度，因而每個檢測器只有一種指定波長的熒光信號進入而被檢測，使光譜帶寬接近熒光染料的發(fā)射峰值。這種濾片稱為帶通〔BP〕濾片。如：FITC檢測器前的濾片標志為530/30，其含義是光譜發(fā)射波長：530±15nm，或者說允許通過的波長范圍在515nm和545nm之間。BP500/50那么表示其允許通過波長范圍為475nm-525nm。流式細胞儀中常用的濾片還有長通濾片〔LP〕和短通濾片〔SP〕，長通濾片使特定波長以上的光通過，特定波長以下的不通過。如LP500濾片，將允許500nm以上的光通過，而500nm以下的光吸收或返回。短通濾片與長通濾片相反，特定波長以下的光通過，特定波長以上的光吸收或返回。〔見圖4-4〕。分光器的主要作用是完成光的收發(fā)。二色性反射鏡就是其中一種。560短通二色性反射鏡如圖4-1所示發(fā)射560nm或小于560nm的波長〔如圖4-1所示〕。大于560nm的波長被反射。圖4-4光線通過長通濾片、短通濾片及帶通濾片的波長范圍習題：光學濾片1檢測器前放置濾片作用是什么。2帶通濾片530/30發(fā)射的波長范圍是到。3用于選擇性地通過特定波段熒光并將另一波段熒光反射至適宜的探測器中。4濾片允許特定波長及以下的光通過，而濾片允許特定波長及以上的光通過。4.3光電探測器處在液流中的粒子通過激光束時產(chǎn)生光信號，這些光信號通過光電探測器轉(zhuǎn)換成電信號〔電壓〕，然后到相應的通道。BD流式細胞儀有兩種類型的光電探測器：光電二極管和光電倍增管〔PMTs〕。光電倍增管〔PMTs〕對光信號比光電二極管敏感，所以前者用于檢測較弱的SSC信號和熒光信號；后者用于檢測較強的FSC信號。粒子進入照射區(qū)開始散射光或熒光時產(chǎn)生充電脈沖，首先光信號或光子由光電倍增管〔PMTs〕或光電二極管轉(zhuǎn)換成相應的電信號，產(chǎn)生電流，電流經(jīng)由放大器，轉(zhuǎn)換成充電脈沖。當粒子位于激光束正中時，脈沖最大，熒光最強。當粒子偏離激光束時，脈沖回到基線〔如圖4-5所示〕。圖4-5充電脈沖的產(chǎn)生充電脈沖的大小取決于光電倍增管前置放大器獲得的光子數(shù)量，放大器可設置為線性放大或者對數(shù)放大〔Lin或Log〕。對數(shù)放大〔Log〕常常用于把陰性信號從微弱的陽性信號中別離出來；而線性放大〔Lin〕通常用于放大散射光信號和熒光信號。充電脈沖通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器把0-1000mV的脈沖轉(zhuǎn)換成為代表0-1,000mV通道的數(shù)值。通道數(shù)值經(jīng)由輸入輸出〔GPIO〕數(shù)據(jù)線傳送到計算機進行處理顯示〔見圖4-6〕。圖4-6模擬信號到數(shù)字信號的轉(zhuǎn)換過程習題：光電探測器1收集FSC光信號。2敏感度高的收集SSC光信號和熒光信號。3探測器產(chǎn)生電流，經(jīng)由放大器轉(zhuǎn)換成電壓?！矊﹀e〕4模數(shù)轉(zhuǎn)換器〔ADC〕的作用。4.4閾值閾值用于設置低于該道值的信號不被處理，只有高于等于閾值道數(shù)的信號才會被送入計算機進行處理。每次只能有一個設閾參數(shù)。如：對免疫表型實驗，閾值應設為FSC，以消除低于閾值道數(shù)的碎片。用戶可根據(jù)實驗要求設置其它參數(shù)的閾值。第二個閾值適用于配有兩個激光器的臺式機。如果設置了兩個閾值，那么粒子必須同時滿足兩個閾值的要求才會被當作信號細胞處理。習題：閾值1FSC閾值用于消除信號。2如果設置兩個閾值，細胞必須符合其中一個閾值的要求才會被當作信號細胞處理?！矊﹀e〕第五章數(shù)據(jù)分析5.1數(shù)據(jù)采集及顯示光信號轉(zhuǎn)換成電壓脈沖后，再通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成為計算機能夠儲存處理的數(shù)字信號。流式細胞儀的數(shù)據(jù)以FSC標準格式存儲，該標準由“分析細胞學協(xié)會”制定。根據(jù)FSC標準，數(shù)據(jù)存儲格式應包括三個文件：樣本獲取文件，數(shù)據(jù)設置文件和數(shù)據(jù)分析結(jié)果。4參數(shù)〔FSC，SSC，F(xiàn)ITC和PE〕的單細胞分析會生成8位數(shù)據(jù)。當單個樣品累計收集到10000個細胞時，F(xiàn)CS數(shù)據(jù)文件為80kB。數(shù)據(jù)采集存儲完畢后，細胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數(shù)如FSC或FITC〔FL1〕可使用直方圖，橫軸表示熒光通道?？v軸表示在該通道內(nèi)收集到的細胞數(shù)量〔如圖5-1〕。處在同一通道的每一細胞均符合該通道的信號值，而且具有相同的信號密度。通道右側(cè)信號的熒光強度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光亮度越強。圖5-1流式數(shù)據(jù)分析圖雙參數(shù)可在二維散點圖中同時顯示，X軸顯示通道1〔FL1〕，Y軸顯示通道2〔FL2〕。3維圖通過X，Y，Z三個軸分別顯示每個通道的細胞量〔如圖5-1〕。習題：數(shù)據(jù)采集及顯示1在直方圖中橫軸和縱軸分別表示。2二維點圖用于顯示參數(shù)。3在CellQuest軟件中3維圖中Z軸代表。5.2設門通過設門的方法可以定義細胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據(jù)FSC或細胞大小，在FSC，SSC的散點圖中設門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細胞亞群的熒光特性。圖5-2全血樣本中淋巴細胞亞群的數(shù)據(jù)分析圖習題：設門1設門的方法通常用于分析樣本內(nèi)的指定細胞?！矊﹀e〕5.3細胞亞群的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析包括從點圖中的list-mode文件中顯示數(shù)據(jù),然后統(tǒng)計點圖中的細胞分布情況。如前所述，分別有幾種形式的點圖用于顯示數(shù)據(jù)，而且可通過設門的方法區(qū)分指定的細胞亞群。如圖5-3所示，在淋巴細胞亞群周圍設門，以單獨分析或分選該亞群細胞。圖5-3選定淋巴細胞亞群設門門內(nèi)細胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。在下面的實例中，我們將詳盡闡述細胞亞群百分含量的不同分析方法。我們可以通過單參數(shù)直方圖，二維點圖和三維圖來分析結(jié)果。單參數(shù)直方圖可定位邊界，二維點圖可設置象限標志。如果需要，還可以建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計表以輸出結(jié)果。直方圖可直觀單個參數(shù)的細胞數(shù)量。陰性對照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界〔見圖5-4〕。左圖中M1為陰性對照峰。右圖中M2為CD3FITC陽性峰。圖5-4陰性對照峰M1〔NORM001〕和CD3FITC陽性峰M2〔NORM002〕圖5-5的統(tǒng)計結(jié)果說明，整個事件共記錄了6000個細胞，門內(nèi)淋巴細胞2891個。其中M1〔陰性〕細胞619個，M2〔CD3陽性〕細胞2272個細胞。淋巴細胞亞群CD3陽性百分含量的統(tǒng)計結(jié)果為：M2：2272/2891=78.59%。圖5-5直方圖統(tǒng)計結(jié)果二維點圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個點表示一個或多個細胞。圖5-6為陰性對照圖，用于設定陰性對照邊界，全圖劃分為四個象限，以區(qū)分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。左下象限〔LL〕為雙陰性細胞，左上象限〔UL〕為Y軸陽性細胞〔CD19PE〕，左下象限〔LR〕為X軸陽性細胞〔CD3FITC〕，右上象限〔UR〕為雙陽性細胞〔CD19+/CD3+〕。圖5-6陰性對照組(NORM001)和CD3FITC/CD19PE雙染樣本(NORM002)如圖5-7所示，淋巴細胞亞群雙陽性細胞〔CD19+/CD3+〕的百分含量為：296/2839=10.43%。圖5-7散點圖統(tǒng)計結(jié)果另一個分析方法是劃定區(qū)域，也就是設門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區(qū)域〔如圖5-8所示〕；然后統(tǒng)計該區(qū)域內(nèi)指定細胞亞群的百分含量。在圖5-9中，R4門內(nèi)為CD4陽性，CD3陰性的淋巴細胞亞群，其結(jié)果為：40/2866=1.40%。圖5-8CD3FITC/CD4PE雙染樣本分析圖圖5-9CD3FITC/CD4PE雙染樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果這種方法在分析不同的供體細胞時存在一個缺陷，因為如果事先定義好細胞亞群的區(qū)域或邊界，在隨后的文件中，下一個樣本的細胞亞群位置會發(fā)生變化，這就需要操作者重新調(diào)整區(qū)域或邊界位置。為防止這種情況的發(fā)生，我們采用一種稱為集群分析〔clusteranalysis〕的新方法。BD公司的MultiSETTM和AttractorsTM軟件就屬于集群分析軟件。該軟件的特點是會隨著整個細胞亞群的移動而移動，自動變換區(qū)域或邊界到相應的細胞亞群位置〔見圖5-10〕。圖5-10使用Attractors分析軟件時二維點圖的前后變化比照5.4流式細胞儀的其它應用以及數(shù)據(jù)分析這些分析方法通常適用于計算離散細胞群的百分含量，對于分析單克隆細胞株分子是否呈陽性并不適用。因為單克隆細胞株是單個細胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統(tǒng)計細胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統(tǒng)計結(jié)果遠遠大于陰性對照組，那么我們認為其結(jié)果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細胞的表達越高，陽性率越高。如圖5-11所示，左圖為單細胞群的散射光信號，右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2，5和20〔從左至右〕。圖5-11單細胞株分析圖除檢測陽性率，幾何均值法和中位法還用于分子〔接合子〕定量分析。QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計算每個細胞的抗體結(jié)合位點數(shù)。如圖5-12所示，Y軸上的圓圈代表從標準曲線獲取的信息，用于計算每個細胞的接合點位數(shù)。圖5-12使用QuantiCALC軟件計算每個細胞的抗體結(jié)合位點數(shù)我們使用ModFitLTTM軟件進行DNA定量分析。因為DNA峰〔G0/G1期，S期和G2M期〕不是離散的，所以我們對曲線以下的面積進行積分，以得到每個細胞亞群的百分含量結(jié)果。圖5-13細胞周期的DNA直方圖習題：數(shù)據(jù)分析1二維點圖和一維直方圖的作用分別是什么？2見圖5-4和圖5-5，CD3陰性和陽性的百分含量分別是多少。3LL象限代表雙陽性細胞亞群?！矊﹀e〕4見圖5-6和圖5-7，淋巴細胞〔CD3+/CD19-〕的百分含量是多少。5只能使用矩形設定細胞區(qū)域范圍?！矊﹀e〕6使用區(qū)域設定法分析樣本有哪些缺乏。7防止細胞亞群移動的分析方法是什么。8在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測陽性率。5.5CellQuest和CellQuestPro軟件使用CellQuest和CellQuestPro軟件是目前運用最為廣泛的流式細胞儀采集及分析軟件。它運行于蘋果電腦上，優(yōu)質(zhì)的矢量圖顯示使得操作界面特別優(yōu)美。現(xiàn)最新的微軟公司的Vista軟件也是仿蘋果操作系統(tǒng)界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuestPro時的強大功能及視覺質(zhì)感。CellQuest和CellQuestPro軟件主安裝在BDFACSCalibur型流式細胞儀上。1．軟件數(shù)據(jù)流程在CellQuest和CellQuestPro軟件的數(shù)據(jù)流分為二個局部：方案和數(shù)據(jù)包。方案是指用戶可以建立采集或分析所需的直方圖或散點圖、設門并定義門與門、門與圖之間的邏輯關系?？梢允褂梅桨高M行數(shù)據(jù)采集或分析以往已有的數(shù)據(jù)。每個采集方案分析樣本后會生成數(shù)據(jù)包，該數(shù)據(jù)包中包括了樣本中每個顆粒在各個檢測參數(shù)上的數(shù)值，格式為FCS2.0或FCS3.0。CellQuest和CellQuestPro方案文件的圖標CellQuest和CellQuestPro方案文件的圖標CellQuest和CellQuestPro數(shù)據(jù)文件的圖標CellQuest和CellQuestPro數(shù)據(jù)文件的圖標CellQuest和CellQuestPro軟件中還會有關于儀器設置的文件，保存所有的實驗條件。它只能由CellQuest和CellQuestPro軟件中還會有關于儀器設置的文件，保存所有的實驗條件。它只能由CellQuest和CellQuestPro軟件翻開。數(shù)據(jù)包必須由方案文件翻開，無法單獨顯示，或者可由第三方軟件進行分析，如WinMDI。2.軟件與儀器的連接流式細胞儀需要加電開啟后會向計算機發(fā)出信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然后再開啟計算機。先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。在蘋果菜單下點擊CellQuest和CellQuestPro軟件。從Aquire菜單下選擇connettocytometer。3．方案與數(shù)據(jù)之間的關系CellQuest和CellQuestPro軟件的方案與數(shù)據(jù)相互獨立保存，數(shù)據(jù)包可以由任一方案文件進行分析，分析后不改變數(shù)據(jù)包中的任何數(shù)據(jù)。CellQuest和CellQuestPro軟件中方案內(nèi)的直方圖或散點圖有三種狀態(tài)：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。當圖的屬性為Acquire時，此圖只限于采集下用，即只當進行檢測時它才能顯示顆粒；當圖的屬性為Analysis時，此圖只限于分析已保存的數(shù)據(jù)包，它不能用于采集數(shù)據(jù)。當圖的屬性為Acquire-Analysis時，此圖即可用于采集數(shù)據(jù)也可用于分析已有數(shù)據(jù)。所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點圖全部設為Acquire-Analysis屬性。CellQuestProCellQuest4．方案的建立A選擇實驗參數(shù)默認情況下，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀開機后只翻開一根激光器，及五個參數(shù)供選擇使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。當我們要使用第二根激光器及FL4通道時需要勾選FL4的選項，儀器自動翻開633nm激光器。選擇FourColor后，儀器自動翻開第二根激光器，且此時FL4可用。選擇FourColor后，儀器自動翻開第二根激光器，且此時FL4可用。B,建立散點圖或直方圖，命名坐標CellQuestPro軟件主要工作界面，軟件類似于Officeword的工作面，可在A4大小的頁面上進行編輯建立各種直方圖或散點圖。使用工具條可以建立散點圖、直方圖并在圖上設立各種門。使用工具條可以建立散點圖、直方圖并在圖上設立各種門。在CellQuestPro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點圖就會出現(xiàn)該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數(shù)、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。在CellQuestPro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點圖就會出現(xiàn)該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數(shù)、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。在CellQuest軟件下，需在選擇Plot菜單，選擇Format來翻開圖的屬性對話框，其中包括了關于該圖所有選項。建立好直方圖或散點圖后，我們需要對所選的參數(shù)進行命名，如不修改軟件自動命名為FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。在菜單上選擇Acquire欄目，選擇ParameterDescription，可出現(xiàn)關于文件存儲和參數(shù)命名的對話框。在這個對話框中用P字母來代表每個參數(shù)，并在此對每個采集參數(shù)進行命名，F(xiàn)L1為CD3FITC，F(xiàn)L2為CD4PE……。C,設門并建立門與圖之間的關系在工具欄上有左側(cè)幾個按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動門。在工具欄上有左側(cè)幾個按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動門。本處重點介紹Snap-To門本處重點介紹Snap-To門，它可根據(jù)細胞群體的分布自動調(diào)整門的形狀適應細胞群體。R與G的關系R是Region的首個字母，Region一般是指一個閉合形的區(qū)域，如矩形區(qū)、自由區(qū)和圓形區(qū)。區(qū)域與區(qū)域之間可以進行邏輯運算，如AND、OR、NOT等關系。當區(qū)域進行運算時軟件引進了算術公式的管理概念：Gate實際了個代數(shù)式，簡稱G，其運算式默認如下：G1=R1，或G2=R2當我們要進行邏輯運算時，可變更為G1=R1ANDR2。此時G1就成了一個算術結(jié)果了。G1=R1ANDR2G2=R1NOTR2G3=R1ORR2RegionList管理門，可以重命名或刪除門。GateList是對門進行邏輯運算和標識顏色的工具。建立門與圖之間的關系翻開要編輯的直方圖或散點圖的屬性對話框，選擇Gate選項，選擇門即可。D，顯示統(tǒng)計參數(shù)如何編輯這些統(tǒng)計參數(shù)選擇統(tǒng)計參數(shù)框，在Stats菜單下的EditStatistic會變得可用，點出后出現(xiàn)統(tǒng)計參數(shù)編輯對話框。選擇任意直方圖或散點圖，在Stats下拉菜單下會有更種統(tǒng)計參數(shù)選項。對應于不同的圖出現(xiàn)不同的統(tǒng)計參數(shù)。如何編輯這些統(tǒng)計參數(shù)選擇統(tǒng)計參數(shù)框，在Stats菜單下的EditStatistic會變得可用，點出后出現(xiàn)統(tǒng)計參數(shù)編輯對話框。選擇任意直方圖或散點圖，在Stats下拉菜單下會有更種統(tǒng)計參數(shù)選項。對應于不同的圖出現(xiàn)不同的統(tǒng)計參數(shù)。5．儀器的操作當計算機與流式細胞儀聯(lián)機后便會出現(xiàn)以下采集控制框：在有關儀器操作所有控制選項框都在Cytometer下拉菜單下，同時按住“蘋果”鍵及1、2、3、4便可調(diào)取所有控制框：6．文件的保存及調(diào)用實驗或分析過程中所建的方案可以保存下來，通File下拉菜單可以保存這些方案文件：如要翻開這些分析方案只需雙建方案圖標即可；方案可以分析以往的數(shù)據(jù)包〔前提是方案中的直方圖或散點圖都已定義成Acquire-Analysis屬性〕，有兩種方案翻開以往的數(shù)據(jù)：方法一：選擇直方圖或散點圖，翻開該圖的屬性框〔Plot->>Format〕，見下列圖：在以上紅色框標注的地方選擇要分析的數(shù)據(jù)包。方法二：選中方案中所有的直方圖或散點圖，翻開Plots菜單，選擇ChangDataFile，翻開要分析的數(shù)據(jù)包。附：CellQuestPro軟件所有下接菜單5.6MutiSet軟件使用MultiSET是BD公司的一個全自動獲取分析軟件。它使用免洗試劑〔TriTEST三色試劑或MultiTEST四色試劑〕制備標本，可以用來做外周血的淋巴細胞及亞型分析，同時使用TruCOUTNT,可以進行絕對計數(shù)。MulSET設門分析，用Attractor定出淋巴細胞亞型區(qū)域。Attractor具有自動檢查細胞位置漂移的功能，并自動居中。因此，使用Mul軟件，可以提高實驗室的工作效率和計數(shù)的精確度。MultiSET文件生成的文件類型：ScheduleDocumentFile(【DDMMYY】．Sch)：日程記錄文件。LaboratoryReportFile(【前綴】【輸入號】．Lab)：實驗室報告，PICT文件。PhysicianReportFile(【前綴】【輸入號】．Phy)：醫(yī)生報告，PICT文件。SummaryReportFile〔【DDMMYY】．Sum〕：總結(jié)報告，PICT文件。FlowCytometryStandard〔FCS〕DataFile〔【前綴】【輸入號】．【試管編號】〕：MultiSET軟件可以獲取或讀取的FCS2.0標準數(shù)據(jù)格式..ExportDocumentFile(【DDMMYY】．Exp)：文本文件,包含標本和試劑信息,以及每管的所有亞群結(jié)果.2.軟件與儀器的連接流式細胞儀需要加電開啟后會向計算機發(fā)出信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然后再開啟計算機。先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。在蘋果菜單下點擊MultiSET軟件(或在Dock界面上點擊MultiSET)..進入MultiSETMultiSET命令菜單參數(shù)預設:ExportPreferences:選擇輸出格式Tab或Comma;選擇報告哪些試驗結(jié)果,按SelectValuestoExport.PrintingPreferences:選擇是否自動打印實驗室報告Laboratoryreport,醫(yī)生報告Physicianreport,總結(jié)報告Summaryreport.PannelsPreferences:預先設定試驗工程Runafixedpanel,或任意選定試驗工程Runanypanel.EventsPreferences:選擇獲取細胞數(shù)量.Levey-JenningsPreferences:選擇質(zhì)控統(tǒng)計,每30個一統(tǒng)計(30runs),每60個一統(tǒng)計(60runs),或不統(tǒng)計(None)MultiSET運行程序ⅰSignIn:輸入操作者、單位、實驗室主任,登記進入MultiSET.ⅱSetUp:建立測試要求.ⅲFACSComp:運行FACSComp,調(diào)整儀器條件.ⅳTestPrefs:規(guī)定報告內(nèi)容.ⅴSamples:輸入標本及病人信息.以下程序自動運行,由MultiSET做提示:ⅵAcquisition:標本獲取.顯示點圖,以便查看標本獲取情況.ⅶAnalysis:結(jié)果分析.顯示點圖,以便查看自動分析過程.ⅷLabReport:做實驗室報告,顯示每個標本的各管結(jié)果.ⅸPhysReport:做醫(yī)生報告,顯示每個標本的結(jié)果及正常值范圍.ⅹSummary:總結(jié).對當次MultiSET的所有標本的結(jié)果做總結(jié).第一步:SignIn:MultiSET軟件的起始頁.●輸入操作者姓名,單位名稱和實驗室主任名稱.儀器自動顯示流式細胞儀的序列號和型號.●點擊Accept,進入下一工作程序.第二步:SetUp:建立測試要求●DataSource選擇數(shù)據(jù)來源.√FromDataFiles:對以前保存的數(shù)據(jù)文件做分析.√FromCytometer:AcquisitionandAnalysis:在流式細胞儀上運行標本,獲得數(shù)據(jù)并分析.√FromCytometer:AcquisitionOnly:在流式細胞儀上運行標本,獲得數(shù)據(jù)不分析.EntryLevelFileNamePrefix確定數(shù)據(jù)文件,實驗室報告,醫(yī)生報告等文件名前綴的使用.ViewReports選擇讀實驗室報告和醫(yī)生報告的時間.AutomaticSavingOptions確定自動保存的文件類型及保存位置.√選擇是否保存DataFiles,LaboratoryReport,PhysicianReport,SummaryReport,ExportDocument.√按Location,選擇文件保存路徑,文件默認路徑BDFiles:MultiSETFiles:【DDMMYY】Folder(自動生成日期目錄).目錄名確認后,按SelectDDMMYY確定,返回SetUp界面..第三步:FACSComp:運行FACSComp,調(diào)整儀器條件選擇LaunchFACSComp,進行Lysenowash校正.如果當日已做校正,那么選擇SkipFACSComp,第四步:TestPrefs:規(guī)定報告內(nèi)容選擇是否報告絕對計數(shù),是否報告正常值范圍,以及總結(jié)報告的形式.Physician’sReportChoices醫(yī)生報告的亞群選項ReportReferenceRanges報告正常值范圍LaboratoryReportChoices選擇實驗室報告內(nèi)容SummaryReportID總結(jié)報告編號第五步:Samples:輸入標本及病人信息輸入標本名稱SampleName,標本編號SampleID及病歷號CaseNumber.PanelName選擇每個標本所做的工程.WBCCount如果您需要絕對計數(shù)結(jié)果,但不用TruCOUNT絕對計數(shù)管,您需要輸入WBC計數(shù)總量和淋巴細胞百分含量,或輸入淋巴細胞計數(shù)總量.注意:調(diào)用條件,翻開Cytometer→InstrumentSettings→Open(FACStation→BDFiles→InstrumentSettingsFiles→CalibFile.LNW或CalibFile如果是對以前檢測的數(shù)據(jù)進行分析,點擊AddSameple,添加數(shù)據(jù),進行分析.第六步:Acquisition:標本獲取.顯示點圖,以便查看標本獲取情況第七步:Analysis:結(jié)果分析.顯示點圖,以便查看自動分析過程.第八步:LabReport:做實驗室報告,顯示每個標本的各管結(jié)果.注:可以點擊ManualGate,此時可以更改點圖大小,更改坐標軸.按照需要,調(diào)整淋巴細胞門或Attractors.第九步:PhysReport:做醫(yī)生報告,顯示每個標本的結(jié)果及正常值范圍.第十步:Summary:總結(jié).對當次MultiSET的所有標本的結(jié)果做總結(jié).5.7SimulSET軟件使用5.8HLA-B27軟件使用HLA-B27自動軟件是BD公司的一個全自動獲取分析軟件。它是專門用來分析人類白細胞抗原B-27基因表達與否。軟件可以自動設門找到CD3+的T細胞群，并分析B27基因是否表達〔表達即為陽性結(jié)果，反之即為陰性〕。HLA-B27軟件為全自動軟件，因此，使用B-27軟件，可以提高實驗室的工作效率和精確度。.HLA-B27生成的文件類型：LaboratoryReportFile(【前綴】【輸入號】．Lab)：實驗室報告，PICT文件。SummaryReportFile〔【DDMMYY】．Sum〕：總結(jié)報告，PICT文件。.ExportDocumentFile(【DDMMYY】．Exp)：文本文件,包含標本和試劑信息,以及每管的所有亞群結(jié)果.軟件與儀器的連接流式細胞儀需要加電開啟后會向計算機發(fā)出信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然后再開啟計算機。先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。在蘋果菜單下點擊FACSComp或B-27軟件(或在Dock界面上點擊FACSComp或B-27軟件圖標)..在FACSComp軟件中用HLA-B27beads調(diào)試儀器條件a.在Dock菜單中FACSComp軟件圖標，點擊出現(xiàn)FACSComp主界面，輸入實驗室操作人員姓名，實驗室和實驗室主任以后，點擊Accept進入SetUp窗口?！不蛘咴谏洗螆?zhí)行2色Calibritebeads分析后，直接點擊SetUp進入SetUp界面〕。b.在SetUp窗口中選擇分析模式：選HLA-B27Calib。注意：要在確認Lyse/Wash(LW)分析模式的結(jié)果通過的情況下，才能進行HLA-B27beads的調(diào)試。c.輸入HLA-B27BeadsLotNumber、Suffix和HLA-B27抗體LotNumber、Suffix，點擊Run，進入調(diào)試窗口。注意：HLA-B27BeadsSuffix和HLA-B27抗體Suffix分別代表了FL1PMT的調(diào)試標準和Cutoffmarker的位置，對于結(jié)果至關重要，不可弄錯。d.點擊start,進入HLA-B27窗口。e.在HLA-B27窗口：在1ml蒸餾水中參加一滴HLA-B27beads混勻后，上機。點擊Start，軟件開始自動調(diào)節(jié)FSC放大器的倍數(shù)和FL1PMT的電壓，獲取結(jié)束后，調(diào)試結(jié)果會被自動保存。f.在Summery窗口：產(chǎn)生CalibrationReport，報告中包含所有你輸入的信息，儀器當前的設置，調(diào)試結(jié)果，F(xiàn)SC及FL1的直方圖等。調(diào)試成功后也就意味著此時的儀器條件可以直接用于HLA-B27自動軟件分析B27基因的表達。進入B27軟件.1B27命令菜單圖.2B27運行程序a.SignIn:輸入操作者、單位、實驗室主任,登記進入B27軟件.b.SetUp:建立測試要求.c.FACSComp:運行FACSComp,調(diào)整儀器條件。前邊已經(jīng)調(diào)試過，直接跳過進入下一步。d.Samples:輸入標本及病人信息.以下程序自動運行,由B27軟件做提示:e.Acquisition:標本獲取.顯示點圖,以便查看標本獲取情況.f.Analysis:結(jié)果分析.顯示點圖,以便查看自動分析過程.g.LabReport:做實驗室報告,顯示每個標本的各管結(jié)果.h.Summary:總結(jié).對當次B27的所有標本的結(jié)果做總結(jié).第一步:SignIn:B27軟件的起始頁.●輸入操作者姓名,單位名稱和實驗室主任名稱.儀器自動顯示流式細胞儀的序列號和型號.●點擊Accept,進入下一工作程序.第二步:SetUp:建立測試要求●DataSource選擇數(shù)據(jù)來源.√FromDataFiles:對以前保存的數(shù)據(jù)文件做分析.√FromCytometer:在流式細胞儀上運行標本,獲得數(shù)據(jù)并分析.FileNamePrefix確定數(shù)據(jù)文件,實驗室報告,醫(yī)生報告等文件名前綴的使用.ViewReports選擇讀實驗室報告和醫(yī)生報告的時間.AutomaticSavingOptions點擊Accept,進入下一工作程序.第三步:Samples輸入標本及病人信息輸入標本名稱SampleName,標本編號SampleID及病歷號CaseNumber.第四步:點擊RunTest上樣本分析單擊圖標，上樣進行試驗。軟件自動執(zhí)行Acqusition、Analysis、LabReport三個步驟，給出報告單，測試結(jié)果自動保存。當進行多個樣本測定時，點擊進行下一個樣本測定。第五步:LabReport:做實驗室報告,顯示每個標本的結(jié)果.第六步:Summary對當次MultiSET的所有標本的結(jié)果做總結(jié)..5.9WinMDI軟件使用WinMDI是一款免費的流式分析軟件，全名為：WindowsMultipleDocumentInterfaceForFlowCytometry,Version2.8。它的作者是：Dr.JosephTrotter，theScrippsResearchInstitute,SanDiego,USA(Dr.Trotter‘se-mailaddress)。在以下網(wǎng)址可以下載到該軟件：://cytometry/files/products/wm28w95(1).exe該軟件運行PC機平臺，適用于Windows2000，XP等操作系統(tǒng)，使用十分方便，可將生成的流式分析圖拷貝至office中。軟件數(shù)據(jù)流程使用WinMDI首先需要數(shù)據(jù)源，這些數(shù)據(jù)源可以來自BD、Coulter或其他各種符合FCS2.0格式的流式數(shù)據(jù)包。注：使用本軟件分析時只需要數(shù)據(jù)包，在BD儀器可以拷貝data文件，Coulter儀器上拷貝LMD文件即可。FCS2.0格式流式數(shù)據(jù)包中包含在實驗中每個被檢測顆粒在各探測器中信號，如1號顆粒的FS、SS、FL1、FL2通道的值，2號顆粒的FS、SS、FL1、FL2通道的值……。數(shù)據(jù)包中沒有關于實驗方案的信息。所以要翻開這些數(shù)據(jù)包需要先建立分析方案，如先建立FS/SS散點圖，然后選擇要分析的文件；建立FL1/FL2散點圖，選擇要分析的文件……。在WinMDI建立的分析方案無法保存，關閉軟件方案即消失，這也是本軟件最大的缺乏之處。軟件與儀器的連接WinMDI是一款純分析型的軟件，它不與任何流式細胞儀相連接。安裝完成后在開始菜單中選擇WinMDI運行它。安裝的過程中要注意：WinMDI安裝軟件wm28w95(1).exe是一個自解壓文件，運行它時會在其所在目錄下生成完整的安裝包〔有很多文件，使得該目錄凌亂不堪〕，所以一定要將wm28w95(1).ex拷在一個獨立的文件下運行。WinMDI的運行程序安裝完成后，程序菜單中應有WinMDI的ICONs，可點擊WinMDI2.8來運行WinMDI。運行程序：開始→所有程序→WinMDI→WinMDI2.8關閉程序關閉所有視窗，點擊每個窗口右上角或者從FileMenu,選擇Exit，點擊Yes.方案與數(shù)據(jù)的關系由于WinMDI軟件的作用是對已有的實驗數(shù)據(jù)進行分析，因此并沒有數(shù)據(jù)流程與采集方案，WinMDI的強項是在后期的數(shù)據(jù)分析方面。對于WinMDI可以讀取的數(shù)據(jù)，可以任意的設定方案進行分析，而這一過程是可重復的。令人遺憾的是WinMDI并沒有提供對設定好的方案進行保存的功能，所以操作者每次翻開數(shù)據(jù)都要重新進行設定方案。數(shù)據(jù)的分析程序以WinMDIDisplay對話方框來開始，其中有4個選項。Histogram為顯示直方圖Dotplot為顯示二維散點圖DensityPlot為密度圖Contour為輪廓圖。對于選定圖形后，要進行相應的參數(shù)選擇，對于直方圖要選擇操作人員所需要的數(shù)據(jù)，而散點圖那么是要選擇所需要的兩個參數(shù)〔如FSC和SSC〕，以及分析細胞的數(shù)量和圖形選項。在對數(shù)據(jù)分析的過程中，一張圖往往是不能滿足分析的需求的。很多情況下對第一個圖形分析完了，需要分析第二個圖形，同時需要兩張圖的比照。WinMDI對此提供非常方便的功能。例如：我們已經(jīng)建立了一個FSC和SSC的散點圖，現(xiàn)在需要分析了以F1和F2為參數(shù)的第二張散點圖，這個時候我們可以單擊Display，在彈出的選項中選擇Dotplot。如果需要的是其他圖形，可以選擇相應的選項。直方圖的的分析對于選定的區(qū)域需要設定Marker，從屏幕上方Tools，選擇MarkerTool,點擊直方圖以激活該圖。點擊峰的左右以設定Marker邊界。改變MarkerIndex為2緊靠marker1設立marker2,點擊OK。點擊直方圖，從下拉菜單項選擇擇Stats得到統(tǒng)計信息。點擊SaveAs保存統(tǒng)計結(jié)果，在filename，鍵入Test.Txt,點擊OK。方案的設門A.散點圖的設門屏幕上方的Tools工具欄，在出現(xiàn)的2DRegionstool框中選R1，并在右側(cè)的RegionStyle中選所需的類型，如“Polygon”。點“Creat”鍵完成選擇。(SortRect畫方形門,Ellipse畫圓形門,Polygon畫多邊形門)。QuadrantTool用于畫十字門在點圖中沿目的細胞群畫多邊形region，圈定目的細胞群。完成后點擊“OK”。如果要刪除R1或?qū)1進行修改，可右擊點圖，選擇Regions，重選R1，Change或Delete。右擊該點圖，選擇“Gates”，出現(xiàn)“Logicgatetool”對話框，從對話框的“Region”中選擇所要分析的Region，并從其右側(cè)的Logic中建立需要的邏輯關系。比方我們在第二張點圖中要分析R1細胞群：從Region中選擇R1，從Logic中選“or”或”and”，完成后點擊OK。該圖僅顯示R1內(nèi)的顆粒。數(shù)據(jù)統(tǒng)計及打印選擇需要分析的參數(shù)，如FL1FITC標記的為Xparameter,FL2PE標記的為Yparameter.點擊Gates點擊And[*]激活門，點擊OK。點擊FL1Vs.FL2點圖任意位置,可見一個下拉菜單。選擇Stats得到門內(nèi)統(tǒng)計圖，出現(xiàn)包括統(tǒng)計信息在內(nèi)的信息框。打印頁面設置從屏幕上方File，選擇FormatPrintPage。出現(xiàn)一張空白頁，我們將復制兩個點圖及統(tǒng)計結(jié)果至該空白頁。點擊FSCVs.SSC點圖使顏色由灰變藍激活點圖。點擊點圖任意位置,可見一個下拉菜單。選擇Copy。點擊FormatPrintPage激活窗口，從Editmenu選擇Paste?？梢奆SCVs.SSC點圖出現(xiàn)在該頁面上。點擊FL1-HVs.FL2-H點圖激活窗口.點擊點圖任意位置,可見一個下拉菜單。選擇Copy，點擊FormatPrintPage激活窗口。選擇Paste?？梢姷诙€點圖出現(xiàn)在該PrintPage.頁面上。排放好兩個點圖，現(xiàn)在可以進行打印，確定PrintPage窗口處于激活狀態(tài)。從FileMenu選擇PrintActive。附：WINMDI軟件主要菜單FileMenu這些指令可用來開啟、儲存檔案、圈選數(shù)據(jù)、以及打印。OpenFile、NextFile、PrevFile、GateFile、SaveAs、List...、ExportData、PrintActive、PrintScreen、FormatPrintPage、Record、Preferences、Exit。EditMenu這些指令可用來編輯統(tǒng)計數(shù)據(jù)的報告型式，以及選擇圖型文件輸出的型式。Undo、Cut、Copy、Paste、Delete、SelectAll、CopyGraphicsFormat、EmptyClipboard、ViewClipboard。DisplayMenu這些指令可用來開啟四種不同圖譜。Histogram、Dotplot、Densityplot、Contour、Format、RetainMarkers、ScreenStats、EditStats。5.10FACSPress軟件使用5.11SystemII軟件使用SYSTEMII軟件運行于CoulterXL型流式細胞儀上，操作系統(tǒng)為MS-DOS，該軟件運行穩(wěn)定功能比擬全面。因為運行在DOS狀態(tài)下，與現(xiàn)在的Windows不兼容，故在圖形輸出時會比擬繁瑣。1、軟件數(shù)據(jù)流程SYSTEMII軟件數(shù)據(jù)分為兩個局部：方案和數(shù)據(jù)包。SYSTEMII中的方案僅供數(shù)據(jù)采集用。數(shù)據(jù)以LISTMODE方式保存，生成后綴為LMD的文件，可用第三方軟件進行分析。SYSTEMII軟件自身也帶有分析模式，即LISTMODE模式，在這個狀態(tài)下可直接翻開數(shù)據(jù)包，因為LMD文件帶有采集方案的信息，故分析時數(shù)據(jù)直接顯示在原采集方案所定義的直方圖或散點圖中，但無法更改、新建或刪除直方圖或散點圖。這一點是該軟件最大的缺陷。2、軟件與儀器的連接開機程序開啟計算機，雙擊“XLON”圖標，啟動流式細胞儀。預熱30分鐘，儀器提示：InsertSampleTube。關機程序退出SYSTEMII軟件假設在DOS方式下開機，那么在C:\XL>狀態(tài)下鍵入“XLOFF”假設在WIN方式下開機，那么返回WINDOWS界面，雙擊“XLOFF”圖標依次關閉計算機主機，打印機，電源箱開關。3、方案與數(shù)據(jù)之間的關系SYSTEMII所建立的方案只能用于采集數(shù)據(jù)，而不能用作分析。數(shù)據(jù)保存后可在LISTMODE下翻開，數(shù)據(jù)會顯示在原采集方案所構(gòu)建的圖形中，無法對圖形進行修改，但能修改圖中的門或增加、刪除門。4、方案的建立將SYSTEMII調(diào)節(jié)至Acquirsition狀態(tài)下，所有有關數(shù)據(jù)采集、新建方案的操作都在此狀態(tài)下進行。A.選擇參數(shù)選擇參數(shù)后，可利用屏幕右上方的UserName將所選擇的信號改成用戶需要的名稱，如將FL1LOG改為FITC于屏幕右下方用鼠標將需要的參數(shù)點成黃色B.利用參數(shù)構(gòu)建直方圖用鼠標將屏幕右上方的參數(shù)點亮，然后放在直方圖的X、Y軸，創(chuàng)立需要的直方圖C.設門及分析單擊鼠標左鍵，將需要設立分析區(qū)域的直方圖放大將屏幕右下角的REGIONEDIT改為CREATE在屏幕右側(cè)選擇分析區(qū)域類型，連續(xù)點擊即可改變。單參數(shù)直方圖分析區(qū)域類型:LIN(線性)雙參數(shù)直方圖分析區(qū)域類型：矩形(REC)任意形(AMO)十字形(QUA)另：數(shù)字形分析區(qū)域：雙參數(shù)直方圖為矩形單參數(shù)直方圖為線性利用GATING建立直方圖之間的關系見上圖,在設立分析區(qū)域的界面下，返回多張直方圖顯示狀態(tài)。選擇所要的分析區(qū)域，如A，并將其點亮，放在所要GATED的直方圖上方。5、儀器操作運行待測樣本，調(diào)整以下參數(shù)PMT(光電倍增管)、電壓(Volts)、增益(Gain)、檢測速度(FlowRate)閾值(Discriminator)、顏色補償(ColorCompensation)選擇預先存儲的方案儀器提示：InsertSampleTube將陰性對照的樣本管放入樣本臺上，儀器會自動檢測樣本管并進行數(shù)據(jù)采集利用FastSet進行電壓的調(diào)整，DISPLAYOPTIONFASTSET用鼠標左鍵點擊FastSet，出現(xiàn)十字標記后，將鼠標移至所需調(diào)整的細胞群，按住左鍵進行調(diào)整，松開左鍵后,儀器會自動重新進行數(shù)據(jù)采集.相應的電壓及增益值會隨之改變。在任何條件不變的情況下，進行樣本測試。假設為雙色以上分析，注意調(diào)整顏色補償調(diào)整顏色補償：利用FASTCOMP進行調(diào)整DISPLAYOPTIONFASTCOMP用鼠標點擊FASTCOMP將鼠標移置所需補償?shù)募毎海现琳Ｎ恢脜⒄涨懊嫠雠袛囝伾a償是否正確7、文件的保存及調(diào)用文件的保存條件事先需要在采集方案中設定好：直方圖存儲方式SAVE/NOSAVE直方圖存儲方式SAVE/NOSAVE存儲方案重新儲存方案，將原方案覆蓋調(diào)用以前所分析的數(shù)據(jù)：進入LISTMODE模式：ACQUISITIONLISTMODESELECT選擇已儲存的文件OKEYPLAYNEXT將文件及圖形翻開SETUPPROTOCOL可以在原有參數(shù)的根底上重新建立直方圖，設立直方圖打印方式REGION(右下角)可以重新設立分析區(qū)域，直方圖之間的關系……5.12MultiCycle軟件使用5.13Modfit使件使用培訓人：受訓人：培訓情況：培訓日期：第6章流式根本檢測工程6.1淋巴細胞亞群檢測〔雙色、三色、四色，三種軟件分析〕實驗原理：人的淋巴細胞根據(jù)其生物功能和細胞外表抗原的表達可分為三大類：T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK自然殺傷細胞。T淋巴細胞表達CD3；B淋巴細胞表達CD19；NK自然殺傷細胞表達CD56或CD16，并且不表達CD3。利用各種單克隆抗體與淋巴細胞外表抗原結(jié)合，再配多色熒光染料，即可以把淋巴細胞區(qū)分為各種亞型。進面得到各亞群的比例。調(diào)試機器：軟件FACSComp。作用：除了校準熒光靈敏度之外，還要調(diào)節(jié)儀器條件。在HLA-B27實驗中，F(xiàn)ACSComp的所有條件都要過，才能啟動B27自動軟件。因為B27檢測的是準確的熒光強度，對靈敏度要求很高。6.1雙色熒光分析血液淋巴細胞免疫表型材料BDSimultestIMKKit試劑盒，主要成分：CD3FITC/CD4PE抗體，CD3FITC/CD8PE抗體，CD3FITC/CD19PE抗體，CD3FITC/CD16+CD56PE抗體，LeucoGATE(CD45FITC/CD14PE),FACSLysingSolution,IsotypeControl(鼠IgG1FITC/IgG2aPE)其他用品準備：蒸餾水、一次性FALCON管實驗操作1、標本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取外周血2ml。2、染色和固定細胞：取六只流式專用管，并標記A-F。六管中分別再參加全血100ul，再在各管中分別參加熒光標記的單克隆抗體試劑20ul，充分混勻，避光孵育15min。在各管中參加2ml1*溶血素，充分混勻，避光反響10-12min.300g離心5min，棄上清液PBS洗滌細胞兩次，300g離心5min，棄上清液1%多聚甲醛0.5mL上機檢測〔SimultestIMKLymphocytes專用軟件也可以使用Cellquest軟件〕；分析結(jié)果；打印實驗報告，圖：6.2三色熒光分析血液淋巴細胞免疫表型材料BDCaliBRITE3熒光校準微球，數(shù)量標準熒光計數(shù)微球的BDTruCOUNT管。BDTriTEST熒光標記抗體，主要成分：CD3FITC/CD4PE/CD45PerCP抗體CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP抗體CD3FITC/CD19PE/CD45PerCP抗體CD3FITC/CD16+56PE/CD45PerCP抗體FACS〔10×〕溶血劑其他用品準備：PBS、蒸餾水、一次性FALCON管實驗操作1、用ACD抗凝采血管收集2ml外周血。2、染色和固定細胞：〔1〕取四只流式專用管，并標記A，B、C、D。〔2〕各管中分別再參加全血100ul，再在各管中分別參加熒光標記的單克隆抗體試劑20ul，充分混勻，避光孵育15min?！?〕 在各管中參加2ml1*溶血素，充分混勻，避光反響10-12min.〔4〕 300g離心5min，棄上清液〔5〕 PBS洗滌細胞兩次，300g離心5min，棄上清液〔6〕 1%多聚甲醛0.5mL上機檢測：使用流式細胞儀，開機以后以CaliBRITE3熒光微球和FACSComp自動軟件檢查儀器靈敏度，并自動設定實驗的獲取條件，然后進入MultiSET自動分析軟件也可以使用Cellquest軟件設置各T淋巴細胞亞群門，獲取15000個白細胞；分析結(jié)果；打印實驗報告，圖：6.3四色熒光分析血液淋巴細胞免疫表型材料MultiTEST?IMKKit試劑盒，主要成分：CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC抗體CD3/CD16+CD56/CD45/CD19抗體FACS〔10×〕溶血劑其他用品準備：蒸餾水、一次性FALCON管實驗操作1、用ACD抗凝采血管收集1ml外周血。2、染色和固定細胞：〔1〕取兩只流式專用管，并標記A，B。〔2〕兩管中分別再參加全血50ul〔先充分混勻〕，再在各管中分別參加熒光標記的單克隆抗體試劑20ul并反復抽吸，充分混勻，避光孵育15min?！?〕在各管中參加450ul1*溶血素，充分混勻，避光反響10-12min.上機檢測〔MultiSET自動軟件〕；分析結(jié)果；打印實驗報告，圖：參考值：(來自于BD公司)6.2B27的檢測HLA-B27分析實驗原理：實驗原理：HLA-B27屬于1型MHC基因。根本上表達在機體所有有核細胞上，特別是淋巴細胞外表有豐富的含量。使用熒光定量標準微球，校正HLA-B27實驗條件后，測定樣本中T淋巴細胞HLA-B27表達水平。假設HLA-B27表達水平大于標準微球設定MARK，那么為陽性結(jié)果；假設HLA-B27表達水平低于標準微球設定MARK，那么為陰性結(jié)果。單克隆抗體與外周血共孵育，裂解紅細胞，洗滌固定后上機檢測。FITC標記的抗-HLA-B27與HLA-B27抗原特異結(jié)合，PE標記的抗-CD3與人類T淋巴細胞特異結(jié)合。調(diào)試機器：在進行HLA-B27抗原檢測之前，要用熒光微球來校準儀器，包括調(diào)節(jié)FL1和FSC。軟件FACSComp1.材料與方法：1.材料ACD抗凝管，1ml外周血，溶血素，雙蒸水，PBS〔含0.1%疊氮鈉〕，1%多聚甲醛〔固定細胞用〕試劑盒介紹：Anti-HLA-B27Kit(美國BD公司；CAT:340183)。Anti-HLA-B27Kit:Anti-HLA-B27FITC/CD3PE1.5mlHLA-B-27Calibrationbeads1.5ml10XLysingSolution30ml2.方法單克隆抗體與外周血共孵育，裂解紅細胞，洗滌固定后上機檢測。2.實驗步驟：1.取樣采靜脈血1ml,肝素抗凝。2.染色和固定取30μl抗HLA-B27FITC/抗CD3PE抗體于試管中,參加50μl抗凝血，混勻，室溫避光孵育15min。然后參加1∶10稀釋的裂解液2ml，避光12min，待紅細胞完全溶解后，立即300g離心5min，棄上清，用PBS洗滌1次，同上離心后棄上清。參加500μlPBS重懸細胞，以備上機檢測。3.FCM檢測：先用CaliBRITEbeads和HLA-B27calibra