植物組織培養(yǎng)論文

植物激素濃度和滅菌消毒時間對植物組織培養(yǎng)狀況影響的探究一.植物祖師培養(yǎng)綜述1.1概念植物的組織培養(yǎng)廣義又叫離體培養(yǎng)，指從植物體別離出符合需要的組織、器官或細胞、原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。狹義組織培養(yǎng)是指用植物各局部組織，如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。1.2研究歷史19世紀30年代，德國植物學家施萊登和德國動物學家施旺創(chuàng)立了細胞學說，根據(jù)這一學說，如果給細胞提供和生物體內(nèi)一樣的條件，每個細胞都應(yīng)該能夠獨立生活；1902年，德國植物學家哈伯蘭特細胞全能性的理論是植物組培的理論根底。1958年，一個振奮人心的消息從美國傳向世界各地，美國植物學家斯蒂瓦特等人，用胡蘿卜韌皮部的細胞進行培養(yǎng)，終于得到了完整植株，并且這一植株能夠開花結(jié)果，證實了哈伯蘭特在五十多年前關(guān)于細胞全能的預(yù)言。近幾十年來植物組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)開展成為一項新興無性繁殖技術(shù)。1.3技術(shù)原理植物組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術(shù)，又稱離體培養(yǎng)，是根據(jù)植物細胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實等〕、組織〔如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等〕或細胞〔如大孢子、小孢子、體細胞等〕以及原生質(zhì)體,在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及溫度等人工條件下，能誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。1.4培養(yǎng)特點培養(yǎng)條件可以人為控制組培采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基和小氣候環(huán)境條件下進行生長，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。生長周期短，繁殖率高組培是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快。另外，植株也比擬小，往往20-30天為一個周期。所以，雖然組培需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說本錢低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，極利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。它是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的開展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲等一系列繁雜勞動，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。二.實驗具體實施方案2.1培養(yǎng)基貯備液以及各種植物激素配制2.1.1培養(yǎng)基簡述培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中離體植物材料賴以生存的“土壤”。不同組織培養(yǎng)類型、外植體需要的培養(yǎng)基配方不同，組織培養(yǎng)是否成功，培養(yǎng)基的選擇具有重要作用。目前常用的培養(yǎng)基有MS、B5、White等。無論何種培養(yǎng)基，都由礦物營養(yǎng)、維生素、碳源、植物激素、有機附加物等無類物質(zhì)組成。在植物組織培養(yǎng)中應(yīng)該培養(yǎng)植物的種類和部位，選擇最適的培養(yǎng)基，才能獲得植物組織培養(yǎng)的成功。本實驗以MS為根本培養(yǎng)基。2.1.2儀器試劑儀器和用具分析天平、恒溫水浴鍋、電爐、量筒、移液管、燒杯、容量瓶、試劑瓶等試劑MS培養(yǎng)基、植物激素BA、植物激素NAA2.1.3步驟1〕根據(jù)擴大倍數(shù)和配制母液量計算每種化合物稱取量；2〕稱取大量元素化合物，分別溶解后順次逐個參加并混合，加水定容止所需體積；3〕稱取微量元素化合物，分別溶解后順次逐個參加并混合，加水定容止所需體積；4〕稱取FeSo4.7H2O和Na2—EDTA，分別溶解后混合，加水定容止所需體積；5〕稱取各種維生素和氨基酸，分別溶解后混合，加水定容止所需體積；6)稱取25mgBA先溶解于1mol/LHCL中，再加水定容至25ml〔1mg/ml〕；7〕稱取25mgNAA，用NaOH溶解后再加水定容至25ml〔1mg/ml〕。附表：MS培養(yǎng)基母液配制表2.1.4考前須知1)注意大量元素母液配制的程序：除鈣鹽外，其他大量元素分別稱量并按順序融于蒸餾水中，鈣鹽單獨配置，組合混合后，用蒸餾水定容；2)微量元素母液配制的小竅門：因其用量小，為稱量方便及精確起見常配置成100或1000倍母液；3)注意不同母液的儲存方法：激素母液裝入棕色試劑瓶中，鐵鹽，有機母液，激素母液放于4度冰箱中，大量元素和微量元素母液常溫下保存于柜子中，NaOH瓶子的瓶塞上應(yīng)纏一圈紙。2.2培養(yǎng)基配制和滅菌2.2.1愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制1〕計算各種母液用量〔按配置1000mlMS培養(yǎng)基計算〕2〕每組取50ml的燒杯一只，按上述用量用量筒或移液管〔不能混用〕，量取或吸取各種母液，放于燒杯中，同時加上激素BA〔濃度2mg/l〕備用；3〕每組取1000ml的燒杯一只，加300ml蒸餾水，參加瓊脂6g，在石棉網(wǎng)上加熱溶解，稱取30g蔗糖放入溶解的瓊脂中，同時參加各種取好的母液，用玻璃棒不斷攪拌混合，并加蒸餾水至1000ml；4〕調(diào)整pH:將培養(yǎng)基攪勻，用pH試紙或pH計測其pH值，可用一定濃度的HCL和NaOH調(diào)節(jié)至5.8；5〕培養(yǎng)基分裝、封口：把配置好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基應(yīng)占試管或三角瓶的1/4-1/3左右為宜，注意不要將培養(yǎng)基沾在管壁上，以免引起污染，分裝后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口，注明培養(yǎng)基名稱及配制時間等。2.2.2繼代培養(yǎng)基配制1〕計算各種母液用量〔按配置1000mlMS培養(yǎng)基計算〕2〕每組取50ml的燒杯一只，按上述用量用量筒或移液管〔不能混用〕，量取或吸取各種母液，放于燒杯中，同時加上激素備用；附表：各組植物激素用量組別一二三四BA濃度〔mg/L〕0.10.50.50.5NAA濃度〔mg/L〕000.10.53〕每組取1000ml的燒杯一只，加300ml蒸餾水，參加瓊脂6g，在石棉網(wǎng)上加熱溶解，稱取30g蔗糖放入溶解的瓊脂中，同時參加各種取好的母液，用玻璃棒不斷攪拌混合，并加蒸餾水至1000ml；4〕調(diào)整pH:將培養(yǎng)基攪勻，用pH試紙或pH計測其pH值，可用一定濃度的HCL和NaOH調(diào)節(jié)至5.8；5〕培養(yǎng)基分裝、封口：把配置好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基應(yīng)占試管或三角瓶的1/4-1/3左右為宜，注意不要將培養(yǎng)基沾在管壁上，以免引起污染，分裝后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口，注明培養(yǎng)基名稱及配制時間等。2.2.3生根培養(yǎng)基配制1〕計算各種母液用量〔按配置1000mlMS培養(yǎng)基計算〕2〕每組取50ml的燒杯一只，按上述用量用量筒或移液管〔不能混用〕，量取或吸取各種母液，放于燒杯中，同時加上激素備用；附表：各組植物激素用量組別一二三四IBA濃度〔mg/L〕0.10.500吲哚丁酸濃度〔mg/L〕001.01.53〕每組取1000ml的燒杯一只，加300ml蒸餾水，參加瓊脂6g，在石棉網(wǎng)上加熱溶解，稱取30g蔗糖放入溶解的瓊脂中，同時參加各種取好的母液，用玻璃棒不斷攪拌混合，并加蒸餾水至1000ml；4〕調(diào)整pH:將培養(yǎng)基攪勻，用pH試紙或pH計測其pH值，可用一定濃度的HCL和NaOH調(diào)節(jié)至5.8；5〕培養(yǎng)基分裝、封口：把配置好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基應(yīng)占試管或三角瓶的1/4-1/3左右為宜，注意不要將培養(yǎng)基沾在管壁上，以免引起污染，分裝后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口，注明培養(yǎng)基名稱及配制時間等。2.2.4培養(yǎng)基滅菌.2.2.4.1普通人工控制的高壓滅菌鍋操作步驟：1〕加水：將水參加高壓滅菌鍋的外層鍋內(nèi)，水位高度與支柱高度一致，連續(xù)滅菌時一定要檢查水位高度，及時注水補充，檢查水位是滅菌前的必要步驟，因為水量缺乏會導(dǎo)致高壓滅菌鍋的損壞；2〕裝鍋：將分裝的培養(yǎng)基和所需的各種用具放入高壓滅菌鍋的滅菌筒內(nèi)，不要過于緊密，三角瓶瓶口向上，蓋好鍋蓋，上好螺絲；3〕排氣：在增壓前將國內(nèi)的冷空氣排盡，使蒸汽能到達各個消毒部位，以保證徹底滅菌，4〕滅菌：當指針移至1.1—1.2Kg/cm2時，將火調(diào)小，保持該壓力15—20min〔在121攝氏度下保持15—20min〕，切斷電源，緩慢放出蒸汽，即到達消毒目的。當壓力逐漸降低到零度后，才能翻開鍋蓋，從鍋中取出滅菌物品，放入白瓷盤，存放于培養(yǎng)室待用。培養(yǎng)基滅菌后取出讓其凝固，直立放置讓其保持平面，有的試管為擴大培養(yǎng)基面積，要求斜放保持鞋面。此時鍋及鍋內(nèi)物品都很燙，操作時需戴加厚的棉手套?？记绊氈?〕鍋內(nèi)冷氣必須排盡，否那么壓力表指針雖然到達一定壓力，但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在并達不到應(yīng)有的溫度因而影響滅菌效果：2〕當?shù)竭_一定壓力后，注意在保持壓力過程中，嚴格控制時間，時間過長會使一些化學物質(zhì)遭到破壞影響培養(yǎng)基成分，時間短那么達不到滅菌效果；3〕三角瓶中的液體不超過總體積的70%，否那么當溫度到達100攝氏度時，培養(yǎng)基會噴溢，造成培養(yǎng)基和包裝紙的污染。2.2.4.2全自動立式高壓蒸汽滅菌鍋操作步驟：1〕檢查滅菌鍋內(nèi)的水位，應(yīng)當浸沒加熱圈并不要高于套桶底部，假設(shè)水量缺乏請參加蒸餾水或去離子水使得加熱圈被浸沒；假設(shè)不慎參加過量的水，請使用底下帶有綠色扳手的排液閥排出多余的水后使水位適宜。滅菌鍋在使用以前排液閥必須關(guān)閉；2〕檢查左側(cè)下方排氣管，使其浸在水盆里，并確保管口一定浸在水面以下；3〕放入要進行高壓滅菌的物品，最好將物品放入滅菌金屬筐內(nèi)，再放入滅菌鍋內(nèi)進行滅菌。將頂蓋轉(zhuǎn)到滅菌鍋正上方并旋緊；4〕關(guān)上平安閥；5〕翻開電源，設(shè)定溫度、時間后并按SET鍵確認；6〕按START鍵開始高壓滅菌；7〕滅菌結(jié)束，滅菌鍋開始發(fā)出警報聲，待溫度降低到80°C仔細檢查壓力表讀數(shù)是否為零，確認為零那么關(guān)閉總電源后可以開啟頂蓋，開啟時操作者應(yīng)頭部略微后仰。開蓋后可以先讓鍋內(nèi)物品稍微冷卻后再取出；8〕假設(shè)由于非常規(guī)原因?qū)е聹缇惓＝K止請使用平安閥放空鍋內(nèi)高壓蒸汽，待壓力表讀數(shù)為零后可以翻開頂蓋。考前須知：1〕任何時候當壓力表顯示壓力不為零絕對不能翻開滅菌鍋頂蓋；9〕任何時候滅菌前請注意：滅菌鍋內(nèi)的水位是否適宜，是否浸沒加熱圈；頂蓋是否已經(jīng)蓋緊；平安閥是否已關(guān)閉；左側(cè)下方排氣管是否浸在水面以下；2〕長期使用或者受到污染的滅菌鍋應(yīng)當用蒸餾水或去離子水進行清洗，使用底下排液閥將清洗液排出，再參加蒸餾水或去離子水到適當?shù)奈恢脗溆茫?〕滅菌時至少要留出約占容器1/4體積的空間，這樣沸騰的液體就不會溢出；4〕滅菌時要把容器的蓋子松開，防止容器內(nèi)壓力過大，致使容器破裂；5〕取出滅好菌的容器前要擰緊容器的蓋子，否那么與空氣接觸容器內(nèi)染菌。2.3植物無菌材料建立和培養(yǎng)2..3.1無菌操作技術(shù)用品超凈工作臺、75％的酒精、950.1粉〕、無菌水等；方法步驟1〕在接種前4h用甲醛與高錳酸鉀混合薰蒸接種室，并翻開紫外燈照射30min；2〕正式接種前半小時左右，翻開超凈工作臺上的紫外燈和風機，20～30min后接種；3〕用肥皂水洗凈雙手，在緩沖間內(nèi)穿好滅過菌的實驗服、帽子與拖鞋，進入接種室；4〕用75％的酒精擦拭工作臺面和雙手；5〕用蘸有75％酒精的紗布擦拭裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進工作臺；6〕把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95；7〕將植物材料進行滅菌消毒處理〔見下表〕植物材料石楠莖段側(cè)柏種子75%酒精消毒30秒，無菌水沖洗2—3次一組、二組氯化汞處理8分鐘，無菌水沖洗3—4次氯化汞處理10分鐘，無菌水沖洗3—4次三組、四組氯化汞處理10分鐘，無菌水沖洗3—4次氯化汞處理15分鐘，無菌水沖洗3—4次8〕用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動瓶口使瓶口各局部都燒到，翻開封口塑料；9〕取下接種器械，在火焰上滅菌；5～10用75％酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95％的酒精中浸泡和在火焰上滅菌；11〕接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺。3.植物培養(yǎng)材料的觀察統(tǒng)計與分析3.1不同滅菌消毒方法對植物材料消毒的影響統(tǒng)計表1材料處理接種瓶數(shù)污染瓶數(shù)污染率存活數(shù)存活率%石楠莖段消毒1消毒2側(cè)柏種子消毒3 消毒4注：消毒1：石楠莖段用75%酒精消毒30秒，無菌水沖洗2—3次；氯化汞處理8分鐘，無菌水沖洗3—4次消毒2：石楠莖段用75%酒精消毒30秒，無菌水沖洗2—3次；氯