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文檔簡介
37毒Diagnostictechniquesofanimaldisease—Part2:Alphaherpesvirus本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定DB37/T4725《動物疫病診斷技術(shù)》是針對畜禽養(yǎng)殖場不同動物疫病的致病原,明確動物疫病病原DB37/T4725擬由以下部分構(gòu)成。皰疹病毒(herpesviruses)是一類有包膜、基因組為雙鏈DNA的病毒。主要分為α皰疹病毒、疹病毒、γ皰疹病毒3種亞型。其中α皰疹病毒對動物的危害程度最大。該病毒感染宿主廣泛,包括豬、動物疫病診斷技術(shù)第2部分:α皰疹病毒本文件適用于豬、雞、牛、馬、驢α皰疹病毒的流行病學調(diào)查、診斷GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范4.1豬偽狂犬病由豬偽狂犬病毒(Porcinepseudorabiesvirus,P4.2雞馬立克氏病傳播,另外,污染的飼料和飲水,以及飼養(yǎng)人員流動也可傳播該病。2月齡~5月齡的雞常4.3牛傳染性鼻氣管炎由牛皰疹病毒1型(Bovineherpesvirus1,Bo由馬皰疹病毒1型、4型或8型(Equineherpesvirustype,母豬分娩前或后1周出現(xiàn)食欲下降甚至廢絕,且出現(xiàn)早產(chǎn),流產(chǎn),產(chǎn)死胎或弱胎;公豬出現(xiàn)睪陰囊腫大,精子活力低。哺乳仔豬感染以后出現(xiàn)高熱潛伏期一般3周~4周,根據(jù)皰疹病毒侵害部位不同,分為四種類5.1.2.1神經(jīng)型:患病雞出現(xiàn)站立不穩(wěn),呈“劈叉”姿勢,翅膀下垂,低頭或斜頸等為典型癥狀。5.1.2.4皮膚型:病雞常出現(xiàn)毛囊腫大或皮膚結(jié)節(jié)。5.1.3.2結(jié)膜角膜炎型:病牛出現(xiàn)結(jié)膜和角膜充血,眼瞼腫大,流淚,角膜渾濁,有壞死性斑點。5.1.3.3生殖器型:病母牛體溫升高,精神沉郁,食欲廢絕,外陰腫脹有小膿皰;出現(xiàn)子宮炎導致流而死亡。孕馬或孕驢出現(xiàn)流產(chǎn),或驢駒死亡。以1歲~2歲馬或驢多發(fā),3歲后呈隱5.2.1.2聚合酶鏈式反應(PCR)檢測與電泳分析TTTGAATTCTTACGACACGGC鑒于PRV的檢測需要區(qū)分野毒感染還是由疫苗免疫造成,以5.2.1.2純化的DNA為模板,利用特異性引物分別進行PCR檢測(引物序列見表2,gE引物用于鑒別野毒,gB引物用于常規(guī)檢測),qACAAGTTCAAGGCCCACATC5.2.1.4野毒分離與檢測分析核酸電泳結(jié)果,或qRT-PCR結(jié)果,選取判定為豬偽狂犬病毒陽性的腦,肺臟或淋巴結(jié)等病料借5.2.1.5數(shù)據(jù)處理分析5.2.2.1采集病料樣品具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%的核酸膠進行電泳分析以5.2.2.2純化的DNA為模版,利用),MDV073-FATTTGATTCAGATTTTGTTTMDV073-R5.2.2.4野毒分離與檢測成3%FBSDMEM,放置培養(yǎng)箱3天~5天,每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變(CPE)。5.2.2.5數(shù)據(jù)處理分析5.2.2.5.3若DEF細胞出現(xiàn)CPE,即細胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉5.2.3.1病料樣品采集以5.2.3.2純化的DNA為模板,利用),5.2.3.4野毒分離與檢測細胞培養(yǎng)液,放置培養(yǎng)箱3天~5天,每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變(CPE)。5.2.3.5數(shù)據(jù)處理分析5.2.4.1病料樣品采集將待測病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模板,借助特異性引物(序列參見表5)進行PCR檢測,具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進行電泳分析,目的片段大小為792bp,482bp或以5.2.4.2純化的DNA為模板,利用),5.2.4.4野毒分離與檢測換成3%FBSMEM,放置培養(yǎng)箱3天~5天,每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變(CPE)。5.2.4.5數(shù)據(jù)處理分析5.3綜合判定若患病動物(豬,雞,牛,馬或驢)出現(xiàn)呼吸困難,流產(chǎn)和神經(jīng)癥狀等,則可判定為疑似α皰疹病毒感染,需借助PCR,熒光定量PCR進行聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR),又稱為無細胞和適溫延伸(72℃)等3個步驟反復的熱循環(huán)構(gòu)成。體系包含DNA聚合酶,引物,模板等,常設(shè)定為30A.3試劑或材料A.3.2對應靶基因的特異性引物。A.3.3實驗室用水參考GB/T66A.3.6Agarose瓊脂糖。A.3.7標準DNA分子量maker。A.4儀器設(shè)備A.4.2核酸電泳儀。A.5試驗步驟用1.0%核酸膠進行分析,待電泳結(jié)束,借助凝膠成像系統(tǒng)觀察1126qRT-PCR是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(PC1117TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGTCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTTCCGCGGCTGCGACGCCGTGCTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGAGGTGTCGTTGGTGGTGTGCCAGCCGCGGGTGCCGAGCGCGTTCAGGCGCGAGGGGCGCAGGTCCACCTCGACGGGGTTCTCGTCGCGGTCGAAGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCGCGGCGGTCGATCACGTCCGTCCTGCACGGGGACGGGCACGCGGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGTTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTGCGGGGCGATGTTCTCCTTGAAGAGCAAGGCGATCCCCTCCGTGAAGTTGCGCCCCGTACTCGGGGCAGGCCTGCTCGGGCTCCAGGAGCACCACCGTGGAGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGTAGAAGCGGTCCCGCTCCGGCCGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGTCCAGGTCGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTATTTGATTCAGATTTTGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCATTCTCTGACTCCACGGATAGAATAGTACGGTTGTACAAGAACCCGTTTTTTATTCAAATGCTCCCCCAATATATTTGGGTTTTGTCTTTCGGCCAGCATTAATGCGCGAACGGACAACAGCGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTTACGACTCGTTCGCGCTCTCGACCGGGGACATTATCTACATGTCGCCCTTTTACGGGCTGCGCGAGGGCGCGCACCGCGACCAGCTACTCGCCGGAGCGCTTCCAGCAGATCGAGGGCTACTACAAGCGCGACATGGCCACGGGCCGGCGCCTCAAGGAGCCGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCACGTGACGGTAGCCTGGGACTGGGTGCCCAAGCGCAAAAACGTGTGCTCGCTGGCCAAGTGGGCGGACGAAATGCTGCGAGACGAGAGCCGCGGGAACTTCCGCTTCACGGCCCGCTCGCTCTCGGCGACCTTTGTGAGCGACAGCCTTCGCGTTGCAGAATGTGCCGCTGAGCGACTGCGTGATCGAAGAGGCCGAGGCCGCGGTCGAGCGCGTCTACCGCGAGCGCGGCACGCACGTGCTGTCGGGCAGCTTGGAGACGC.8牛皰疹病毒1型gB基因qRT-PCR參考序列(大小為97CTGGCACACGACGGACGATGTGTACACGGCGCTGGGCTCGGCGGGGCTCTACCGCACGGGCACCTCTGTGAACTGCATCGAACCTCAGCCAACCCAAGATGGTGTGCATAGAGAACAAATTCTACATCGCTTGCACAAACGAGCAGTGGAGGCAACGGCCCGATTCTTCCAACGTCACCGCCAAACAGCTGGAGCTCATCAAAACCACGTCGTCTATCGAGTTTGCCATGCTACAGTTTGCACACATCCAATCCCACGTCAATGAAATGCTAAGTAGAATAGCAACTGCGTGGTGTACCCTCCAAAACAAAGAGCGGACCCTATGAATGGTGAAGATTAACCCGAGCGCCATAGTCTCCGCAACCCTTGACGAGCGAGTTGCAGCGAGGGTCCTGGGGGACGTGATAGCTATAACGCACTGCGCCAAAATAGAGGGCAACGTGTACTTGCAAAACTCCATGCGCTCGATGGACAGTAACACGTGCTACTCCCGCCCCACATTTACAATTACTAAGAATGCAAACAACAGAGGGTCGATAGAAGGCCAGCTGGGAGAGGAGAACGAGATTTTCACGGAGCGCAAGCTGATCGAGCCGTGCGCCCTCAATCAGAAGCGCTACTTTAAGTTTGGCAAAGAGTACGTTTACTACGAGAACTACACGTTCGTCCGTGCCCCCCACGGAAATCGAGGTTATCAGCACGTACGTTGAACTAAACTTGACCCTTTTGGAAGACCGCGAGTTTCTGCCCCTGGTACACGCGGGCTGAGCTGGAGGACACCGGCCTGCTAGACTACAGCGAAATACAGCGCCGCAACCAGCTCCACGCTCTCAGGGCCATACGTCCCTGTCCGACAGATACAATGACAGGGTTCCGGTTTCGGTGGAGGAGATCTTCGGTCTCATCGACAGTAAGATGTTCGTCAAAGGCCGAGTACCTCAGAGATAACATCATGCACCACGCGTACCACGACGACGAGGACGAGGTGGAGCTTGATTTGGTGCCGTCCAAGTTTGCAACTCCGGGGGCCAGAGCCTGGCAGACCACCAACGATACTACGTCTTACGTGGGGTGGATGCCATGGAGGACGTCAACGTCTGTCAACTGCATCGTCGAGGAGGTGGAGGTTGCCGCAACTCGCTCGTCAAGAGTGGCGGAAACAATAGCGCTTGGGTTAACCTTTACCATCTCATTCCAGAGGGTCCGCGTTTTGTAGTGTACACCACGCAGTTGCTATCCTACTTAGCATCTCATTAACGTGGGATTGGATGTGATCGTATGCAAACTGTAGCAAACTCAATAGAGGACGTTGTTTTGATTAGCTCTAGTTGTTTGGCGGTGACGTTGGAAGAGTTTGTACTATTCGCAGCCTCCCGTTTGTGTAGGCGATGTAGTATTTGTTCTCTGTGGAGGCTCTCTTGGGTTGGAGTAGGTTCTGGTATTGATAGTAGCGACCTTCGATTGGTATTATGGTTTGCGTTGGGGTTTAACAGATTTTTTAGGTCATAGG
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