微生物生長(zhǎng)教材

微生物的生長(zhǎng)1、掌握微生物純培養(yǎng)的方法2、掌握測(cè)定微生物生長(zhǎng)繁殖的方法3、掌握微生物的生長(zhǎng)規(guī)律4、了解理化因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響5、了解微生物生長(zhǎng)的控制1、第一節(jié)微生物純培養(yǎng)的生長(zhǎng)微生物在自然界中不僅分布很廣，而且都是混雜地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必須把混雜的微生物類群分離開來，以得到只含一種微生物的培養(yǎng)。微生物學(xué)中將在實(shí)驗(yàn)室條件下從一個(gè)細(xì)胞或一種細(xì)胞群繁殖得到的后代稱為純培養(yǎng)。純培養(yǎng)的分離，是研究和利用微生物的第一步，是微生物工作中最重要的環(huán)節(jié)之一。最常用的方法有稀釋平板法、劃線法、單細(xì)胞挑取法及利用選擇培養(yǎng)基分離法等。純培養(yǎng)的分離方法稀釋倒平板法（或涂布法）選擇培養(yǎng)基分離法單細(xì)胞挑取法平板分離法平板劃線法稀釋倒平板法（傾注法、涂布法）這是最常用的純種分離法，先將待分離的材料作一系列的稀釋(如1：10、1：100、1：1000、1：10，000……)，然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基相混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，平皿上就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。

平板劃線法將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，用接種環(huán)沾取少許待分離的材料，在培養(yǎng)基表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物將隨著劃線次數(shù)的增加而分散，經(jīng)保溫培養(yǎng)形成菌落。劃線開始的部分細(xì)菌分散度小，形成的菌落往往連在一起。由于連續(xù)劃線，微生物逐漸減少，劃到最后，?？尚纬蓡蝹€(gè)孤立的菌落。這種單個(gè)菌落可能由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來，故可獲得純培養(yǎng)。用其他工具如彎形玻璃代替接種環(huán)，在培養(yǎng)基表面涂布，亦可得到同樣結(jié)果。此法較為簡(jiǎn)便。單細(xì)胞挑取法這種方法是從待分離的材料中挑取一個(gè)細(xì)胞來培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)。具體方法是將顯微鏡挑取器裝置在顯微鏡上，把一滴菌懸液置于載玻片上，用安裝在顯微鏡挑取器上的極細(xì)的毛細(xì)吸管，在顯微鏡下對(duì)準(zhǔn)某一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞挑取，再接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此法需要非常熟練的操作人員，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。

利用選擇培養(yǎng)基分離法不同微生物需要不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。有些微生物生長(zhǎng)適于酸性環(huán)境，有些則適于堿性環(huán)境。各種微生物對(duì)不同的化學(xué)試劑如消毒劑(酚)、染料(結(jié)晶紫等)、抗生素及其他物質(zhì)等具有不同的抵抗能力。利用這些特性，便可配制成適合于某種微生物生長(zhǎng)而限制其他微生物生長(zhǎng)的各種選擇性培養(yǎng)基，以達(dá)到純種分離的目的。另外，也可以將待分離的樣品先進(jìn)行適當(dāng)處理，以消除不希望分離到的微生物。對(duì)一些生理類型比較特殊的微生物，為了提高分離機(jī)率，往往在涂布分離前先進(jìn)行富集培養(yǎng)，其目的是提供一個(gè)特別設(shè)計(jì)的培養(yǎng)環(huán)境，以幫助所需的特殊生理類型的微生物的生長(zhǎng)，而不利于其他類型微生物的生長(zhǎng)。主要是指利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定環(huán)境條件使僅適應(yīng)該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。選擇培養(yǎng)基分離法1.dilutesample1ml9ml10

1001000104105

106107牛肉膏培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基高氏培養(yǎng)基

微生物純培養(yǎng)分離方法的比較

稀釋平板法既可定性，又可定量，用途廣泛

平板劃線法方法簡(jiǎn)便，多用于分離細(xì)菌

單細(xì)胞挑取法局限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究

利用選擇培養(yǎng)基法適用于分離某些生理類型較特殊的微生物微生物的培養(yǎng)方法一、良好的微生物培養(yǎng)裝置的基本條件按微生物的生長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行科學(xué)的設(shè)計(jì)，提供豐富、均勻的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。保證微生物獲得適宜的溫度和良好的O2條件。為微生物提供適宜的理化條件。嚴(yán)防雜菌的污染。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法厭氧菌的固體培養(yǎng)高層瓊脂柱厭氧培養(yǎng)皿厭氧罐技術(shù)液體培養(yǎng)法好氧菌的液體培養(yǎng)厭氧菌的液體培養(yǎng)試管液體培養(yǎng)臺(tái)式發(fā)酵罐搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的微生物培養(yǎng)法

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厭氧罐anaerobicjar掛曲小曲紅曲近代人工踏制大曲AwholeprocessofDA-QUprepationfermenter3、微生物的個(gè)體生長(zhǎng)1.細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)1.1細(xì)菌染色體的復(fù)制1.2細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的擴(kuò)增1.3核糖體的建成1.4細(xì)胞分裂離心法控制溫度選擇法：根據(jù)微生物細(xì)胞在不同生長(zhǎng)階段體積與質(zhì)量不完全相同的原理設(shè)計(jì)的，2-3較常用。選擇法過濾法4、微生物同步培養(yǎng)(synchronousculture)

使培養(yǎng)基中細(xì)菌同時(shí)分裂，處于相同的生長(zhǎng)階段叫同步生長(zhǎng)。膜洗脫法誘導(dǎo)法控制培養(yǎng)基成分誘導(dǎo)法：主要是控制環(huán)境條件，如溫度、營(yíng)養(yǎng)物或能夠影響周期中主要功能的代謝抑制劑等，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，但抑制細(xì)胞分裂，然后將環(huán)境條件恢復(fù)到最適，大多數(shù)細(xì)胞就同時(shí)出現(xiàn)分裂。離心法控制溫度選擇法：根據(jù)微生物細(xì)胞在不同生長(zhǎng)階段體積與質(zhì)量不完全相同的原理設(shè)計(jì)的，2-3較常用。選擇法過濾法

膜洗脫法誘導(dǎo)法控制培養(yǎng)基成分誘導(dǎo)法：主要是控制環(huán)境條件，如溫度、營(yíng)養(yǎng)物或能夠影響周期中主要功能的代謝抑制劑等，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，但抑制細(xì)胞分裂，然后將環(huán)境條件恢復(fù)到最適，大多數(shù)細(xì)胞就同時(shí)出現(xiàn)分裂。離心法控制溫度選擇法：根據(jù)微生物細(xì)胞在不同生長(zhǎng)階段體積與質(zhì)量不完全相同的原理設(shè)計(jì)的，2-3較常用。選擇法過濾法

膜洗脫法誘導(dǎo)法控制培養(yǎng)基成分誘導(dǎo)法：主要是控制環(huán)境條件，如溫度、營(yíng)養(yǎng)物或能夠影響周期中主要功能的代謝抑制劑等，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，但抑制細(xì)胞分裂，然后將環(huán)境條件恢復(fù)到最適，大多數(shù)細(xì)胞就同時(shí)出現(xiàn)分裂。

選擇法又稱機(jī)械篩選法，是通過物理學(xué)方法從隨機(jī)、不同步群體中選擇出同步的群體。此法可在不影響微生物代謝的情況下獲得同步培養(yǎng)物。若微生物在相同發(fā)育階段大小不一，則不適宜用此法。舉例：過濾分離法、密度梯度離心法、膜洗脫（常用）等。

誘導(dǎo)法誘導(dǎo)因子：不影響微生物生長(zhǎng)，可特異性抑制細(xì)胞分裂，消除該抑制后，細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)分裂。此法會(huì)擾亂細(xì)胞的正常代謝舉例：

1、溫度調(diào)整法；

2、營(yíng)養(yǎng)條件調(diào)整法；

3、抑制DNA合成法（代謝抑制劑：）（抑制DNA合成法是利用代謝抑制劑阻礙DNA合成相當(dāng)一段時(shí)間，然后解除其抑制，可達(dá)到同步目的。常用的代謝抑制劑：氨甲蝶呤、羥基尿素、5-氟脫氧尿苷、胸腺苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷等。）

5、微生物的群體生長(zhǎng)微生物特別是單細(xì)胞微生物，體積很小，個(gè)體的生長(zhǎng)很難測(cè)定，而且也沒有什么實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此，在微生物學(xué)的研究和應(yīng)用中，通常是測(cè)定群體的增加量，即群體的生長(zhǎng)。測(cè)定不同種類、不同生長(zhǎng)狀態(tài)微生物的生長(zhǎng)情況，需要選用不同的指標(biāo)。通常對(duì)單細(xì)胞微生物來說，既可測(cè)定細(xì)胞數(shù)目，又可測(cè)定生長(zhǎng)量；而對(duì)多細(xì)胞微生物(尤其是絲狀真菌)，則常以菌絲生長(zhǎng)的長(zhǎng)度等作為生長(zhǎng)指標(biāo)。

表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目或群體細(xì)胞物質(zhì)的增加，因此群體生長(zhǎng)的測(cè)定方法可以分為細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定或細(xì)胞物質(zhì)總量的測(cè)定兩類。

（一）微生物細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定

－－適用于單細(xì)胞微生物或絲狀微生物的孢子1、直接計(jì)數(shù)法－－全菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法（常用）2、平板菌落計(jì)數(shù)法－－活菌計(jì)數(shù)法

1）澆注平板法

2）涂布平板法3、薄膜過濾計(jì)數(shù)法：利用微孔薄膜過濾法測(cè)定空氣和水中的微生物數(shù)量。

4、比濁法：懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，與透

光度成反比，可利用比色計(jì)或分光光度計(jì)測(cè)定透

光率或光密度。1、直接計(jì)數(shù)法－－全菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法（常用）2、平板菌落計(jì)數(shù)法－－活菌計(jì)數(shù)法

1）澆注平板法2）涂布平板法細(xì)胞。3、薄膜過濾計(jì)數(shù)法：利用微孔薄膜過濾法測(cè)定含菌較少的空氣和水中的微生物數(shù)量。4、比濁法：懸液中細(xì)胞濃度與混濁度(光密度)成正比，菌數(shù)越多，光密度越大，與透光度成反比，可利用比色計(jì)或分光光度計(jì)測(cè)定透光率或光密度，就可反映菌液的濃度。血球計(jì)數(shù)板

各種型號(hào)的全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀活菌計(jì)數(shù)的一般步驟

……含

（二）細(xì)胞物質(zhì)總量的測(cè)定方法(直接法)稱重法含氮量測(cè)定法N×6.25=PrDNA能和3，5-二氨基苯甲酸-鹽酸溶液顯示特殊熒光的原理，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度求得DNA含量，可直接反映所含細(xì)胞物質(zhì)的量。還可根據(jù)DNA含量計(jì)算細(xì)菌數(shù)量，每個(gè)細(xì)菌平均含DNA８.４x１０-５ｎｇ．DNA含量測(cè)定法

1、稱重法：干重法和濕重法。微生物的干重一般為其濕重的10%-20%。濕重法對(duì)于細(xì)菌等單細(xì)胞微生物可通過離心收集菌體直接稱重，對(duì)于絲狀微生物需過濾后用濾紙吸干菌絲之間的自由水再稱重。干重法即將樣品放在已知質(zhì)量的容器內(nèi)于1050C烘干至恒重，然后放到干燥器內(nèi)冷卻再稱重。2、含氮量測(cè)定法

蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量比較穩(wěn)定，而氮又是蛋白質(zhì)的重要組成，因此可用蛋白質(zhì)含量反映菌體數(shù)和細(xì)胞物質(zhì)的量。從一定量培養(yǎng)物中分離細(xì)菌，洗滌，用凱氏定氮法測(cè)定總含氮量，再乘以系數(shù)6.25換算成細(xì)胞蛋白質(zhì)總含量。3、DNA含量測(cè)定法

DNA作為微生物的重要遺傳物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)的含量相當(dāng)恒定。根據(jù)DNA能和DABA-2HCl（20%3,5-二氨基苯甲酸-鹽酸溶液）顯示特殊熒光的原理，通過測(cè)定熒光反應(yīng)強(qiáng)度求得DNA含量，可直接反映所含細(xì)胞物質(zhì)的量。還可根據(jù)DNA含量計(jì)算細(xì)菌數(shù)量，每個(gè)細(xì)菌平均含DNA8.4ｘ10-5ng微生物的連續(xù)培養(yǎng)單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)

單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線微生物的高密度培養(yǎng)微生物的連續(xù)培養(yǎng)

單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線微生物的高密度培養(yǎng)細(xì)菌群體的生長(zhǎng)規(guī)律（生長(zhǎng)曲線）總菌數(shù)活菌數(shù)Ⅱ.對(duì)數(shù)期（指數(shù)期）細(xì)菌細(xì)胞快速分裂階段，細(xì)菌數(shù)按幾何級(jí)數(shù)增加。代謝活性最強(qiáng)，酶活力高而穩(wěn)定，組成新細(xì)胞物質(zhì)最快，生長(zhǎng)速率最大。代時(shí)最短，對(duì)環(huán)境變化敏感。Ⅲ.穩(wěn)定期（恒定期）:增殖的細(xì)菌與死亡的相等，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡，生長(zhǎng)速率趨于零，活菌數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定。不超40代。出現(xiàn)細(xì)菌分裂速率降低，代時(shí)延長(zhǎng)，細(xì)胞代謝活

力減退。開始積累貯藏物，如肝糖粒、異染顆粒、脂肪粒等。大多數(shù)芽孢細(xì)菌在此時(shí)形成芽孢。這一時(shí)期活菌總數(shù)最高，是積累代謝產(chǎn)物的重要階段。Ⅳ.衰亡期：細(xì)菌死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，活菌總數(shù)下降，出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。細(xì)胞開始自溶，

釋放代謝產(chǎn)物，菌體出現(xiàn)多種形態(tài)，甚至畸形，芽孢菌釋放芽孢。Ⅰ.延遲期：不立即繁殖，細(xì)胞數(shù)幾乎保持不變。細(xì)菌細(xì)胞分裂雖遲緩，但代謝活躍，細(xì)胞體積增長(zhǎng)快。細(xì)菌數(shù)目（個(gè)/ml）對(duì)數(shù)ⅡⅢⅣⅠ縮短延滯期的意義和方法1、延滯期出現(xiàn)原因本期特點(diǎn)影響本期限長(zhǎng)短因素1）延滯期出現(xiàn)原因

把細(xì)菌接種到新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，并不立即進(jìn)行分裂繁殖，細(xì)菌增殖數(shù)為０，這時(shí)細(xì)胞需要合成多種酶，輔酶和某些中間代謝產(chǎn)物，以適應(yīng)新的環(huán)境為細(xì)胞分裂作準(zhǔn)備，要經(jīng)過一個(gè)調(diào)整和適應(yīng)過程。

2）延滯期特點(diǎn)細(xì)胞分裂遲緩，但代謝活躍，細(xì)胞體積增長(zhǎng)快細(xì)胞質(zhì)均勻

容易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶對(duì)不良條件抵抗能力降低蛋白質(zhì)和ＲＮＡ含量高3、影響延滯期限長(zhǎng)短因素接種菌齡菌種的遺傳性培養(yǎng)基成分4、縮短延滯期的意義和方法可以縮短生產(chǎn)周期，提高設(shè)備利用率。接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，采用最適菌齡加大接種量與培養(yǎng)菌種相同組成分的培養(yǎng)基改善菌種的遺傳特性2、指數(shù)期(對(duì)數(shù)期)：細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)過延遲期的調(diào)整后，便進(jìn)入快速分裂階段，細(xì)菌數(shù)按幾何級(jí)數(shù)增加

1）特點(diǎn)該期的細(xì)菌生產(chǎn)中多被用做種子和科學(xué)試驗(yàn)材料①活菌數(shù)和總菌數(shù)接近②酶活力高而穩(wěn)定，代謝旺盛。③生長(zhǎng)速率最大，generationtime最短。④細(xì)胞的化學(xué)組成及形態(tài)，生理特性比較一致x2x1t2t1培養(yǎng)時(shí)間Lg細(xì)胞數(shù)/mlt2-t13.322(lgx2-lgx1)生長(zhǎng)速率常數(shù)R=t2-t13.322(lgx2-lgx1)代時(shí)G=指數(shù)期生長(zhǎng)的數(shù)學(xué)模型繁殖代數(shù)n=3.322(lgx2-lgx1)2）影響指數(shù)期的因素菌種營(yíng)養(yǎng)成分不同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度4)指數(shù)期應(yīng)用3、穩(wěn)定期（恒定期）1)穩(wěn)定期特點(diǎn)

活菌數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定，生長(zhǎng)速率趨于零?；罹倲?shù)最高，是積累代謝產(chǎn)物的重要階附段芽孢桿菌這時(shí)開始形成芽孢。這是生產(chǎn)收獲時(shí)期?；钤鲋车募?xì)菌與死亡的相等，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡營(yíng)養(yǎng)的消耗有害代謝產(chǎn)物積累PH值EH值等理化條件不適2)出現(xiàn)原因營(yíng)養(yǎng)物比例失調(diào)一般連續(xù)繁殖不超過40代（1）對(duì)于以收集菌體或與菌體生長(zhǎng)相平行的代謝產(chǎn)物為目的的發(fā)酵生產(chǎn)，穩(wěn)定期是最佳時(shí)期。3)工業(yè)應(yīng)用延長(zhǎng)措施：可通過通氣、補(bǔ)料、調(diào)節(jié)PH、調(diào)整溫度4、衰亡期1)特點(diǎn)細(xì)菌死亡數(shù)大于增殖數(shù),活菌數(shù)明顯減少,群體衰落細(xì)胞出現(xiàn)多形態(tài),大小不等的畸形,變成衰退型細(xì)胞死亡,出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。2)原因培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)菌越來越不利，引起細(xì)胞內(nèi)分解代謝明顯超過合成代謝，導(dǎo)致大量菌體死亡，是衰亡期產(chǎn)生的主要原因長(zhǎng)短菌種的遺傳特性有關(guān)，不同微生物差別較大細(xì)菌生長(zhǎng)曲線對(duì)指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)的意義?絲狀微生物的群體生長(zhǎng)培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)菌越來越不利，引起細(xì)胞內(nèi)分解代謝明顯超過合成代謝，導(dǎo)致大量菌體死亡，是衰亡期產(chǎn)生的主要原因長(zhǎng)短菌種的遺傳特性有關(guān)，不同微生物差別較大細(xì)菌生長(zhǎng)曲線對(duì)指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)的意義?

（三）微生物的連續(xù)培養(yǎng)

將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長(zhǎng)，最后一次收獲，此稱分批培養(yǎng)(batchculture)。通過對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線的分析可知，在分批培養(yǎng)中，培養(yǎng)基一次加入，不予補(bǔ)充，細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不可能長(zhǎng)時(shí)間維持。如果在培養(yǎng)器中不斷補(bǔ)充新鮮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并及時(shí)不斷地以同樣速度排出培養(yǎng)物(包括菌體及代謝產(chǎn)物)，理論上講，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期就可無限延長(zhǎng)。這種方法就叫連續(xù)培養(yǎng)法。連續(xù)培養(yǎng)方法的出現(xiàn)，不僅可隨時(shí)為微生物的研究工作提供一定生理狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)材料，而且可提高發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效益和自動(dòng)化水平。此法已成為當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展方向。優(yōu)點(diǎn)：減少了非生產(chǎn)時(shí)間，縮短發(fā)酵周期；提高了設(shè)備利用率，

便于自動(dòng)化控制；產(chǎn)物質(zhì)量均一穩(wěn)定缺點(diǎn)：菌種易退化；易染雜菌

(一)恒化連續(xù)培養(yǎng)控制恒定的流速，使由于細(xì)菌生長(zhǎng)而耗去的營(yíng)養(yǎng)物及時(shí)得到補(bǔ)充，培養(yǎng)室中營(yíng)養(yǎng)物濃度基本恒定，從而保持細(xì)菌的恒定生長(zhǎng)速率，故稱恒化連續(xù)培養(yǎng)，又叫恒組成連續(xù)培養(yǎng)。

(二)恒濁連續(xù)培養(yǎng)

不斷調(diào)節(jié)流速而使細(xì)菌培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法叫恒濁連續(xù)培養(yǎng)。在恒濁連續(xù)培養(yǎng)中裝有濁度計(jì)，借光電池檢測(cè)培養(yǎng)室中的濁度(即菌液濃度)，并由光電效應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)強(qiáng)弱變化，來自動(dòng)調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速。

裝置控制對(duì)象培養(yǎng)基培養(yǎng)液流速生長(zhǎng)速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無限制生長(zhǎng)因子不恒定最高速率大量菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)液流速（外控制）有限制生長(zhǎng)因子恒定低于最高速率不同生長(zhǎng)速率的菌體實(shí)驗(yàn)室為主恒濁器與恒化器的比較生長(zhǎng)限制因子:凡處于較低濃度范圍內(nèi)可影響生長(zhǎng)速率和菌體產(chǎn)量的某營(yíng)養(yǎng)物。

第二節(jié)理化因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響溫度氧化氧氣氧化還原電位水分輻射

一、溫度影響微生物生長(zhǎng)繁殖的最重要因素之一。溫度

嗜冷菌

其生長(zhǎng)溫度范圍在－10～20℃，最適生長(zhǎng)溫度為15℃或以下，它們常分布在地球兩極地區(qū)的水域和土壤中。嗜冷機(jī)制：①酶系在低溫下仍能起催化作用

②細(xì)胞膜含較多的不飽和脂肪酸，在低溫下仍具有通透性。嗜溫菌

絕大多數(shù)微生物屬于這一類。最適生長(zhǎng)溫度在20～40℃之間，最低生長(zhǎng)溫度10～20℃，最高生長(zhǎng)溫度40～50℃。它們又可分為室溫型（25℃）和體溫型（37℃）。

微生物按其最適生長(zhǎng)溫度范圍可分為：嗜冷菌嗜溫菌嗜熱菌

嗜熱菌

它們適于在45～50℃以上的溫度中生長(zhǎng)，在自然界中的分布僅局限制于某些地區(qū)，如溫泉、日照充足的土壤表面、堆肥堆、發(fā)酵飼料等腐爛有機(jī)物中，比如堆肥在發(fā)酵過程中溫度常高達(dá)60～70℃。嗜熱機(jī)制：

①細(xì)胞內(nèi)的酶具強(qiáng)抗熱性。

②產(chǎn)生的多胺，熱亞胺和高溫精胺物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)等組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。

③核酸也具有熱穩(wěn)定性的保護(hù)結(jié)構(gòu)。

④細(xì)胞膜含有較多的飽和脂肪酸和直鏈脂肪酸，使膜具有穩(wěn)定性。二、輻射輻射：可見光、紅外線、紫外線、x射線和r射線等殺菌原理間接作用：自由基直接作用

三、氧氣

專性好氧菌：需氧，正常大氣壓下呼吸產(chǎn)能以呼吸為主，兼營(yíng)發(fā)酵產(chǎn)能好氧菌兼性厭氧菌

以呼吸為主，兼營(yíng)厭氧呼吸產(chǎn)能

微好氧菌：需要微量氧下生活

耐氧菌：不需氧，只以發(fā)酵產(chǎn)能，氧無毒害厭氧菌

(專性)厭氧菌：氧有害或致死，以發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能

氧與細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)系

專性好氧菌（obligateorstrictaerobes）

必須在較高濃度分子氧的條件下才能生長(zhǎng)，有完整的呼吸鏈，以分子氧作最終氫受體，具有超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（Catalase）。絕大多數(shù)真菌和多數(shù)細(xì)菌、放線菌都是專性好氧菌。兼性厭氧菌（facultativeanaerobes）

在有氧條件下生長(zhǎng)為主（以呼吸產(chǎn)能），兼在厭氧條件下生長(zhǎng)（以發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能）。細(xì)胞內(nèi)含有SOD和過氧化氫酶。許多酵母菌和不少細(xì)菌都是兼性厭氧菌。微好氧菌（microaerophilicbacteria）

在較低氧分壓下才能正常生長(zhǎng)。通過呼吸鏈以氧作最終氫受體而產(chǎn)能。耐氧菌（aerotolerantanaerobes）在分子氧存在下進(jìn)行發(fā)酵性厭氧生活。不需要氧，氧對(duì)其無害。不具有呼吸鏈，依靠專性發(fā)酵和底物水平磷酸化獲得能量。細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過氧化物酶（缺乏過氧化氫酶）。通常的乳酸菌多為耐氧菌。厭氧菌（anaerobes）

可分為一般厭氧菌和嚴(yán)格厭氧菌。

厭氧菌（anaerobes）將環(huán)境中氧吸掉；抽真空；深層培養(yǎng)氧對(duì)其有毒

能量來源于發(fā)酵、無氧呼吸、環(huán)式光合磷酸化或甲烷發(fā)酵O2.-超氧陰離子自由基普遍存在H2O+1/2O2

過氧化氫酶（好氧菌）2H2O過氧化物酶（耐氧菌）NADH2NADO2.+2H+H2O2+O2

-SOD（好氧菌及耐氧菌）1

1

1

細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶A.

+

B.A:B

共價(jià)結(jié)合均裂氧化還原電位作用機(jī)理：氧化還原電位影響為生物細(xì)胞中許多酶的活性，并影響呼吸作用。好氧菌：+0.1v以上，以0.3v-0.4v為宜厭氧菌：+0.1v以下，-0.1v為宜水分

等滲溶液對(duì)微生物生長(zhǎng)有利，細(xì)菌處于低滲液中會(huì)吸水膨脹乃至破裂，細(xì)胞處于高滲液中會(huì)脫水引起質(zhì)壁分離，導(dǎo)致死亡。用鹽漬（5-30%）和密餞（30-80%）的方式保存食品。1、氫離子濃度（PH）

影響細(xì)胞膜透性與穩(wěn)定性影響物質(zhì)溶解度

影響細(xì)胞表面電荷分布

因此影響微生物生長(zhǎng)、繁殖，發(fā)育。各類微生物能夠生長(zhǎng)的PH值較寬，但細(xì)胞內(nèi)部PH值卻接近中性。微生物的活動(dòng)也能改變環(huán)境中的PH值化學(xué)因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

嗜酸性微生物（pH小于5.4）

嗜堿性微生物（pH=7.0-11.5）嗜中性微生物根據(jù)氫離子濃度對(duì)微生物分類2、重金屬及其化合物都有殺菌作用，是殺菌劑和防腐劑，作用最強(qiáng)的是Hg,Ag,Cu,作用機(jī)理：重金屬帶正電，容易和帶負(fù)電的菌體蛋白結(jié)合使其凝固變性，使酶失活。（與E的－SH結(jié)合）重金屬鹽類是蛋白質(zhì)的沉淀劑。酪AA+I2→二碘酪氨酸3、鹵素及其化合物

碘殺菌力強(qiáng)，3－7％碘溶于70－83％的乙醇中成碘酒。

氯及氯化物常用于水及食品消毒與水結(jié)合放出原子氧（O）用于消毒。氯，碘是常用的消毒劑4、有機(jī)化合物醇、醛、酚是常用的殺菌劑。

殺菌機(jī)制①損傷CW

②使蛋白質(zhì)變性（細(xì)胞膜，E失活）

③抑制脫氫酶，氧化酶活性。

5、染色劑干擾菌體氧化還原電位

阻礙芽孢的形成。

染料陽離子與菌體的羧基或磷酸基形成弱電離化合物，妨礙菌體的正常代謝，抑制菌體生長(zhǎng)。

微生物生長(zhǎng)的控制幾個(gè)基本概念物理滅菌因素的代表—高溫化學(xué)殺菌劑、消毒劑和治療劑消毒(disinfection)：殺死或消除物體上的病原微生物的方法滅菌（sterilition）：殺死物體上全部微生物的方法防腐(antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生長(zhǎng)的方法幾個(gè)基本概念化療(chemotherapy)：利用對(duì)病源菌具有高度毒力而對(duì)宿主基本無毒的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病源微生物的生長(zhǎng)繁殖驚人的數(shù)據(jù)一、控制微生物生長(zhǎng)的物理方法高溫滅菌低溫抑菌輻射干燥和滲透壓過濾除菌超聲波

火焰灼燒法（焚燒滅菌法）

干熱滅菌法

烘箱熱空氣滅菌法：1710C-1h;160-2h;121-12h高溫滅菌

巴氏消毒法

常壓下煮沸消毒法:100-15min

濕熱滅菌法

間歇滅菌法

常規(guī)加壓滅菌法

加壓下

連續(xù)加壓滅菌法高溫滅菌濕熱滅菌效果比干熱滅菌效果好

焚燒滅菌法（火焰灼燒法）

此法滅菌徹底，迅速簡(jiǎn)便，但使用范圍有限。常用于接種工具、污染物品以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體等廢棄物的處理。烘烤熱空氣法主要在干燥箱中利用熱空氣進(jìn)行滅菌。通常170℃處理1h、或160℃加熱2h、或121℃加熱12h便可達(dá)到滅菌的目的。如果被處理物傳熱性差、體積較大或堆積過擠時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。此法只適用于玻璃器皿、金屬用具等耐熱物品的滅菌。其優(yōu)點(diǎn)是可保持物品干燥。

煮沸滅菌法（煮沸消毒法）

物品在水中煮沸15min，可殺死所有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。在水中加入１％的Ｎa2CO3或２～５％的碳酸效果更好。此法適合注射器和解剖用具的消毒。

高壓蒸汽滅菌(normalautoclving)是濕熱滅菌中最好的方法，通常在1.05kg/cm2的壓力下（此時(shí)溫度121oＣ）處理15～30min。要排冷，否則會(huì)形成假壓，雖然壓力達(dá)到要求，溫度卻達(dá)不到相應(yīng)高度，而影響滅菌效果。

間歇滅菌法(fractionalsterilization)是用常壓蒸汽反復(fù)幾次進(jìn)行滅菌的方法。

主要用于不宜高壓滅菌的培養(yǎng)基，不耐熱的藥物和營(yíng)養(yǎng)物等。方法是將待滅菌物品置于蒸鍋內(nèi)加熱到沸騰維持15～30min殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，取出冷卻后在37oＣ恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，使芽孢萌發(fā)，再用此法滅菌，反復(fù)三次，即可達(dá)到滅菌目的。

巴氏消毒法(pasteurization)是食品（牛奶）釀造（啤酒）工業(yè)中常用的方法。具體做法是62.9oＣ處理30min或71.6oＣ處理15min。這樣即可殺死病原微生物。又不致?lián)p壞營(yíng)養(yǎng)，可保留食品飲料原有用味。根據(jù)結(jié)核桿菌在62oＣ下15min被致死。低溫維持法;高溫瞬時(shí)滅菌低溫抑菌低溫的作用主要是抑菌。它可使微生物的代謝活力降低，生長(zhǎng)繁殖停滯，但仍能保持活性。低溫法常用于保藏食品和菌種。包括冷藏法和冷凍法輻射輻射主要有紫外光、電離輻射、強(qiáng)可見光?？捎糜诳刂莆⑸锷L(zhǎng)和保存食品。紫外線：波長(zhǎng)265～266nm的紫外線殺菌力最強(qiáng)。紫外輻射對(duì)微生物有明顯的致死作用，是強(qiáng)殺菌劑。由于紫外線穿透能力差，不易透過不透明的物質(zhì)，故紫外殺菌燈只適用于空氣及物體表面消毒。紫外輻射的殺菌機(jī)制是復(fù)雜的，現(xiàn)知主要是由于它對(duì)

DNA的作用，最明顯的是形成胸腺嘧啶二聚體。經(jīng)紫外輻射處理后，受損傷的微生物細(xì)胞若再暴露于可見光中，一部分可恢復(fù)正常，稱光復(fù)活現(xiàn)象。X射線與r射線直接學(xué)說間接學(xué)說

r射線是放射性元素Co60發(fā)射出的高能射線，具強(qiáng)穿透能力，500－干倫琴劑量用于誘變育種，10萬倫琴以上具殺菌作用。干燥和滲透壓微生物代謝離不開水。干燥或提高溶液滲透壓降低微生物可利用水的量或活度，從而抑制其生長(zhǎng)。過濾除菌過濾除菌是將液體通過某種多孔的材料，使微生物與液體分離，現(xiàn)今大多用膜濾器除菌。此法可用于對(duì)熱敏感液體的滅菌，如含有酶或維生素的溶液、血清等，還可用于啤酒生產(chǎn)代替巴氏消毒法。超聲波超聲波(頻率在20000Hz以上)具有強(qiáng)烈的生物學(xué)作用。其作用是使細(xì)胞破裂，內(nèi)含物外溢，從而實(shí)現(xiàn)殺滅微生物的目的。幾乎所有的微生物都能受其破壞?？蒲兄谐Ｓ么朔ㄆ扑榧?xì)胞，以研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成、抗原結(jié)構(gòu)和酶的活性等。二、控制微生物生長(zhǎng)的化學(xué)方法消毒劑和防腐劑抗代謝物抗生素

化學(xué)治療劑是指能直接干擾病原微生物的生長(zhǎng)繁殖并可用于治療感染性疾病的化學(xué)藥物，按其作用和性質(zhì)又可分為抗代謝物和抗生素。消毒劑和防腐劑消毒劑是可抑制或殺滅微生物，對(duì)人體也可能產(chǎn)生有害作用的化學(xué)藥劑，主要用于抑制或殺滅非生物體表面、器械、排泄物和環(huán)境中的微生物。防腐劑是可以抑制微生物但對(duì)人和動(dòng)物毒性較低的化學(xué)藥劑，可用于機(jī)體表面如皮膚、黏膜、傷口等處防止感染，也可用于食品、飲料、藥品的防腐。理想的消毒劑和防腐劑應(yīng)具有作用快、效力大、滲透強(qiáng)、易配制、價(jià)格低、毒性小、無怪味的特點(diǎn)。

1、醇類

醇類是脫水劑、蛋白質(zhì)變性劑，也是脂溶劑，可使蛋白質(zhì)脫水、變性，損害細(xì)胞而具殺菌能力。70%～75％的乙醇?xì)⒕Ч詈茫Ｓ糜谄つw及器械的消毒。醇類物質(zhì)，隨著分子量的增大，殺菌力增強(qiáng)。例如戊醇＞丁醇＞丙醇＞乙醇＞甲醇。那些高級(jí)醇雖殺菌力強(qiáng)于乙醇，由于丙醇以上的醇不易與水相混，故一般不用作消毒劑。

2、醛類

醛類的作用主要是使蛋白質(zhì)烷基化，改變酶或蛋白質(zhì)的活性，使微生物的生長(zhǎng)受到抑制或死亡。常用的醛類是甲醛，37％～40％甲醛溶液稱福爾馬林，因有刺激性和腐蝕性，不宜在人體使用，常以2％甲醛溶液浸泡器械，10％甲醛溶液進(jìn)行熏蒸以消毒廠房、無菌室或者傳染病患者的家具、房屋等。

3、酚類

低濃度的酚可破壞細(xì)胞膜組分，高濃度的酚可凝固菌體蛋白。酚還能破壞結(jié)合在膜上的氧化酶與脫氫酶，引起細(xì)胞的迅速死亡。

石炭酸

O.5％可消毒皮膚，2％～5％可消毒痰、糞便與器皿，5％可噴霧消毒空氣。甲酚

是酚的衍生物，殺菌效果比苯酚強(qiáng)幾倍，但在水中的溶解度較低，可在皂液或堿性溶液中形成乳濁液。市售的消毒劑來蘇爾就是甲酚與肥皂的混合液，常用3％～5％的溶液消毒皮膚、桌面及用具。

4、表面活性劑

主要是破壞菌體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，造成胞內(nèi)物質(zhì)泄漏、蛋白質(zhì)變性、菌體死亡。肥皂一種陰離子表面活性劑，對(duì)肺炎鏈球菌或鏈球菌有效，但對(duì)葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌無效，0.25％的肥皂溶液對(duì)鏈球菌的作用比0.7％來蘇爾或0.1％的升汞還強(qiáng)，但一般認(rèn)為肥皂的作用主要是機(jī)械地移去微生物，微生物附著于肥皂泡沫中被水沖洗掉。新潔爾滅人工合成的季銨鹽陽離子表面活性劑，0.05％～0.1％新潔爾滅溶液用于皮膚、黏膜和器械消毒。

5、染料一些堿性染料的陽離子可與菌體的羧基或磷酸基作用，形成弱電離的化合物，妨礙菌體的正常代謝，抑制生長(zhǎng)。例如：結(jié)晶紫。6、氧化劑類氧化劑作用于蛋白質(zhì)的巰基，使蛋白質(zhì)和酶失活，強(qiáng)氧化劑還可破壞蛋白質(zhì)的氨基和酚羥基。常用的氧化劑有鹵素（碘酒、氯氣等）、過氧化氫、高錳酸鉀。

7、重金屬高濃度的重金屬及其化合物都是有效的殺菌劑或防腐劑，其作用最強(qiáng)的是Hg、Ag和Cu。升汞l﹕（500～2000）液可殺滅大多數(shù)細(xì)菌，腐蝕金屬，對(duì)動(dòng)物有劇毒，常用于組織分離時(shí)外表消毒和器皿消毒。紅汞2％紅汞水溶液即紅藥水常消毒皮膚、黏膜及小創(chuàng)傷，不可與碘酒共用。銀是溫和的消毒劑，0.1％～l％硝酸銀可消毒皮膚，l％硝酸銀可防治新生兒傳染性眼炎。硫酸銅對(duì)真菌和藻類有強(qiáng)殺傷力，與石灰配制的波爾多液可防治某些植物病害。

8、酸堿類強(qiáng)酸與強(qiáng)堿具有殺菌力。無機(jī)酸如硫酸、鹽酸等殺菌力雖強(qiáng)，但腐蝕性大，實(shí)際上不宜作消毒劑。某些有機(jī)酸如苯甲酸可用作防腐劑。酸菜、飼料青貯則是利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸抑制腐敗性微生物的生長(zhǎng)，使之得以久貯存。強(qiáng)堿可用作殺菌劑，但由于它們的毒性大，其用途局限于對(duì)排泄物及倉(cāng)庫(kù)、棚舍等環(huán)境的消毒。

類型

名稱及使用方法

作用原理

應(yīng)用范圍

醇類70%—75%乙醇脫水、蛋白質(zhì)變性皮膚、器皿

醛類0.5%—10%甲醛2%戊二醛（pH=8）蛋白質(zhì)變性房間、物品消毒（不適合食品廠）

酚類3%—5%石炭酸2%來蘇兒3%—5%來蘇兒破壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)變性地面、器具皮膚地面、器具氧化劑0.1%高錳酸鉀3%過氧化氫0.2%—0.5%過氧乙酸氧化蛋白質(zhì)活性基團(tuán)，酶失活皮膚、水果、蔬菜皮膚、物品表面水果、蔬菜、塑料等常用的消毒防腐劑及其應(yīng)用（1）

常用的消毒防腐劑及其應(yīng)用（2）類型

名稱及使用方法

作用原理

應(yīng)用范圍重金屬鹽類0.05%—0.1%升汞2%紅汞0.1%—1%硝酸銀0.1%—0.5%硫酸銅蛋白質(zhì)變性、酶失活變性、沉淀蛋白蛋白質(zhì)變性、酶失活非金屬器皿皮膚、粘膜、傷口皮膚、新生兒眼睛防治植物病害表面活性劑0.05%—0.1%新潔爾滅0.05%—0.1%