果膠酶應(yīng)用基理及活性檢驗(yàn)方法

果膠酶應(yīng)用基理及活性檢測(cè)方法-1-2316:57:21伴隨大家對(duì)健康環(huán)境保護(hù)紡織品需求增加和各國(guó)政府對(duì)環(huán)境保護(hù)強(qiáng)制力度加大,在紡織印染行業(yè)中一個(gè)新型紡織助劑———生物酶制劑應(yīng)用逐步發(fā)展起來(lái)?，F(xiàn)在,一個(gè)基于果膠酶新型紡織生物助劑正在應(yīng)用推廣中,它關(guān)鍵用于棉、麻前處理工藝。因?yàn)榧徔椘髽I(yè)多數(shù)對(duì)果膠酶生物特征不甚了解,在工藝應(yīng)用過(guò)程中缺乏對(duì)應(yīng)檢測(cè)手段,使其推廣受到限制。酶活力(活性)是衡量酶生物活性及含量關(guān)鍵指標(biāo),所以,建立適適用于紡織行業(yè)果膠酶酶活檢測(cè)方法,是十分迫切和必需。2果膠酶酶促作用機(jī)理果膠酶是一類復(fù)合酶,是指分解果膠質(zhì)多個(gè)酶總稱。我們測(cè)定酶活值通常是這一類復(fù)合酶協(xié)同作用綜合結(jié)果。果膠酶可分為兩大類:解聚酶和果膠酯酶。解聚酶關(guān)鍵是經(jīng)過(guò)水解作用和反式消去作用,切斷果膠和果膠酶分子α-1,4糖苷鍵,將果膠分子降解為小分子。果膠酯酶作用是使果膠分子中甲酯水解,最終形結(jié)果膠酸。果膠質(zhì)關(guān)鍵是由Ｄ-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵連接形成直鏈狀聚合物。部分Ｄ-半乳糖醛酸上羧基被甲醇酯化、形成甲酯,或被一個(gè)或多個(gè)堿部分或全部中和。果膠質(zhì)在植物細(xì)胞組織中起著“粘合”作用,在棉纖維初生胞壁中,果膠質(zhì)含量約占9%,而麻纖維則更高。經(jīng)過(guò)果膠酶作用,將果膠質(zhì)降解為小分子物質(zhì),從纖維中游離出來(lái),可使和其粘合在一起其它雜質(zhì)(如蠟質(zhì)、蛋白質(zhì)、灰份等)和纖維素根本分開,達(dá)成棉精煉或麻脫膠目標(biāo)。對(duì)于紡織行業(yè),需要是將果膠催化水解成可游離出纖維、小分子物質(zhì)果膠酶活性(力),所以,關(guān)鍵測(cè)定解聚酶活力。解聚酶對(duì)果膠分子酶促催化作用表現(xiàn)為,每切斷一個(gè)果膠分子α-1,4糖苷鍵,就會(huì)形成一個(gè)還原性醛基。經(jīng)過(guò)測(cè)定這些還原性醛基生成量,即可判定解聚酶酶活力。3測(cè)定酶活力(性)基礎(chǔ)原理酶作為一個(gè)生物催化劑,其酶活力值是和其催化效率及有效(即有生物活性)酶含量相關(guān)。酶活力是酶在單位時(shí)間內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化為反應(yīng)產(chǎn)物能力,以Ｕ(ｍｏｌ/時(shí)間)表示,底物即是酶催化反應(yīng)物。通常,酶制劑活力是以Ｕ/ｇ酶制劑(或Ｕ/ｍＬ酶制劑)表示,把酶制劑量和活力聯(lián)絡(luò)在一起,稱為“比活力”。在特定條件下,經(jīng)過(guò)測(cè)定單位量某種酶制劑在單位時(shí)間內(nèi)催化足夠量底物生成反應(yīng)產(chǎn)物量,即可測(cè)出此酶制劑比活力。依據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)米氏學(xué)說(shuō),從酶被底物飽和現(xiàn)象出發(fā),根據(jù)“穩(wěn)態(tài)平衡”假說(shuō)設(shè)想,可推導(dǎo)出以下公式:產(chǎn)物生成速率=ｋ3[總酶][底物]/([底物]+ｋｍ)(1)式中:[總酶]———酶總濃度(ｍｏｌ/ｍＬ);[底物]———底物濃度(ｍｏｌ/ｍＬ);

ｋ3———在酶促反應(yīng)第二步,形成最終產(chǎn)物速率常數(shù);ｋｍ———米氏常數(shù)(ｍｏｌ/ｍＬ),其值是當(dāng)酶反應(yīng)速率達(dá)成最大反應(yīng)速率二分之一時(shí)底物濃度。要估量[總酶],首先要固定全部可控制獨(dú)立變量,如ｐＨ值、溫度等。當(dāng)[底物]>>Ｋｍ時(shí),底物對(duì)反應(yīng)速率影響可忽略(酶飽和),酶促反應(yīng)達(dá)成最大反應(yīng)速率Ｖｍａｘ,其結(jié)果是:產(chǎn)物生成速率=ｋ3[總酶]=Ｖｍａｘ=ＵＵ就成為總酶量一個(gè)測(cè)量。所以,能夠經(jīng)過(guò)測(cè)定Ｕ來(lái)反應(yīng)酶制劑中有效酶蛋白含量。4果膠酶酶活測(cè)定方法概述和比較測(cè)定果膠酶酶活方法有很多,但基礎(chǔ)上全部是利用酶促分解果膠產(chǎn)生粘度下降或生成還原性醛基來(lái)測(cè)定果膠酶酶活。這些方法概括起來(lái)關(guān)鍵有粘度降低法、滴定法和分光光度法3種。本文分別選擇一個(gè)較經(jīng)典測(cè)定方法加以介紹。4.1粘度降低法4.1.1原理果膠溶于水后形成粘稠狀溶液,其粘度和溶解度和其聚合和酯化程度相關(guān)。能夠利用果膠這種性質(zhì),測(cè)其酶活力。即在一定溫度、酶濃度下和一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi),測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)果膠溶液粘度降低率。4.1.2操作方法浴中保溫10ｍｉｎ后,加入1ｍＬ酶液,繼續(xù)保溫,在不一樣時(shí)間分別測(cè)定反應(yīng)混合液流出粘度計(jì)小球時(shí)間。對(duì)照試驗(yàn)采取經(jīng)熱處理已失活酶液。4.1.3計(jì)算粘度下降百分?jǐn)?shù)可用下式表示:粘度下降(%)=100(Ｔｏ-Ｔ)/(Ｔｏ-Ｔα)(2)式中:Ｔ、Ｔｏ和Ｔα分別為反應(yīng)混合液、對(duì)照混合液和緩沖液流出時(shí)間(ｓ)。酶溶液要預(yù)先稀釋,使粘度降低范圍在20%～80%。在此范圍內(nèi),酶濃度對(duì)數(shù)和粘度降低率成正比。以酶作用時(shí)間為橫坐標(biāo)、粘度下降百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,在圖中查出粘度下降50%時(shí)對(duì)應(yīng)酶作用時(shí)間(Ｔ1/2)。在上述條件下,引發(fā)粘度下降50%酶量為10個(gè)果膠酶活力單位,即酶活單位=10/(Ｔ1/2/3600)。4.2滴定法4.2.1原理果膠酶根本水解果膠,生成半乳糖醛酸;半乳糖醛酸可和碘(過(guò)量)反應(yīng)。反應(yīng)后剩下碘可用硫代硫酸鈉溶液滴定,據(jù)此可得出酶解反應(yīng)產(chǎn)生半乳糖醛酸量。以生成半乳糖醛酸量衡量果膠酶活力。4.2.2測(cè)定方法取1%果膠溶液10ｍＬ,加入到5ｍＬ酶液和5ｍＬ水,調(diào)ｐＨ至3.5,在50℃水浴中保持2ｈ,取出加熱煮沸。冷卻后,取5ｍＬ反應(yīng)液移入碘量瓶中,加1Ｍ碳酸鈉溶液1ｍＬ,0.1Ｎ碘液5ｍＬ,搖勻,加塞,于室溫下放置20ｍｉｎ,加2Ｎ硫酸2ｍＬ,用0.05Ｎ硫代硫酸鈉滴定至淡黃色,加0.5%淀粉指示劑1ｍＬ,繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為止。統(tǒng)計(jì)所消耗硫代硫酸鈉毫升數(shù)Ａ。空白試驗(yàn)用10ｍＬ果膠溶液、10ｍＬ水,不加酶液,不經(jīng)保溫,直接取此混合物5ｍＬ于100ｍＬ三角瓶中用于滴定,統(tǒng)計(jì)消耗硫代硫酸鈉毫升數(shù)Ｂ。4.2.3計(jì)算

在上述條件下,1ｈ酶促轉(zhuǎn)化果膠、生成1ｍｇ當(dāng)量游離半乳糖醛酸所需酶量定為一個(gè)酶活單位。每毫升酶液活力單位=(Ｂ-Ａ)Ｎ×0.51×20.(5×2×5)(3)式中:Ｎ———硫代硫酸鈉當(dāng)量濃度;0.51———1ｍｇ當(dāng)量硫代硫酸鈉相當(dāng)于0.51ｍｇ當(dāng)量半乳糖醛酸;20———分解果膠反應(yīng)液總體積數(shù);5、2、5———分別表示反應(yīng)中加入酶液毫升數(shù)、反應(yīng)時(shí)間、滴定時(shí)所取反應(yīng)液毫升數(shù)。4.3分光光度法4.3.1原理果膠酶分解果膠,產(chǎn)生帶有還原性醛基還原糖(以半乳糖醛酸計(jì)),部分顯色劑可和其發(fā)生顯色反應(yīng)。依據(jù)顏色深淺不一樣,能夠經(jīng)過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定果膠酶酶活值大小。本文以最常見(jiàn)ＤＮＳ比色法介紹此檢測(cè)方法,其顯色劑為3,5-二硝基水楊酸。4.3.2操作方法取0.5%果膠溶液0.5ｍＬ加入到0.5ｍＬ酶液中,搖勻。在50℃水浴中正確反應(yīng)0.5ｈ,取出后,快速在沸水浴中加熱5ｍｉｎ,冷卻。取0.5ｍＬ反應(yīng)液移入加有0.5ｍＬＤＮＳ試劑試管,加4ｍＬ蒸餾水,搖勻,在沸水浴中加熱5ｍｉｎ,快速冷卻。用分光光度計(jì)在540ｎｍ處測(cè)其吸光度值。參比液配制:加熱滅活5ｍｉｎ0.5ｍＬ稀釋酶液和0.5ｍＬ0.5%果膠溶液充足混合。4.3.3計(jì)算采取標(biāo)準(zhǔn)曲線法,配制一系列已知濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,在540ｎｍ處測(cè)定吸光度(Ａ),以葡萄糖濃度(Ｃ)為橫坐標(biāo)、吸光度(Ａ)為縱光標(biāo)作Ａ.Ｃ標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見(jiàn)5.2節(jié)圖2)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得公式:Ａ=斜率×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)(4)未知試液測(cè)定吸光度值Ａ后,可經(jīng)過(guò)上式求得Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)。在上述條件下,每小時(shí)內(nèi)每毫升果膠酶酶促轉(zhuǎn)化果膠生成1ｍｇ當(dāng)量還原糖(以半乳糖醛酸計(jì))所需酶量定義為一個(gè)酶活單位。即:果膠酶活(ｍｇ半乳糖醛酸/ｍＬ·ｈ)=酶液稀釋倍數(shù)×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)×2×194/180(5)式中:194/180———葡萄糖換算成半乳糖醛酸量;2———測(cè)定中稀酶液被0.5%果膠溶液稀釋倍數(shù)。4.43種方法比較將粘度降低法用來(lái)測(cè)定果膠酶復(fù)合酶活力比較正確,但操作過(guò)程也相對(duì)復(fù)雜,且測(cè)定靈敏度不高。滴定法設(shè)備使用簡(jiǎn)單,測(cè)試重現(xiàn)行好,正確度高,但測(cè)定時(shí)間長(zhǎng),過(guò)程較繁瑣,試劑用量較大。而分光光度法測(cè)定靈敏度、正確度均高,重現(xiàn)性好,試劑用量少,尤其是操作省時(shí)、簡(jiǎn)便。對(duì)于上述3種測(cè)定方法,依據(jù)紡織行業(yè)特點(diǎn),筆者認(rèn)為分光光度法更適于紡織工作者應(yīng)用。下面關(guān)鍵探討ＤＮＳ比色法在實(shí)際應(yīng)用中部分具體問(wèn)題。5應(yīng)用ＤＮＳ比色法測(cè)定果膠酶酶活

5.1果膠溶液配制和酶液稀釋果膠溶液配制濃度和酶液稀釋倍數(shù)是相互聯(lián)絡(luò)兩個(gè)數(shù)據(jù),它們確實(shí)定對(duì)酶活測(cè)定結(jié)果正確性起著關(guān)鍵作用。經(jīng)過(guò)完成以下試驗(yàn),能夠確定相關(guān)參數(shù)條件。5.1.1材料和方法5.1.1.1儀器和試劑ＵＶ—9200分光光度計(jì);果膠(Ｓｉｇｍａ)、果膠酶制劑(ＮＯＶＯ)、3,5-二硝基水楊酸、巴比妥酸、巴比妥鈉。5.1.1.2溶液配制ＤＮＳ試劑:將6.3ｇ3,5-二硝基水楊酸、262ｍＬ2ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ加到500ｍＬ含182ｇ酒石酸鈉熱水溶液中,再加5ｇ苯酚及5ｇ亞硫酸鈉,待溶解、冷卻后,加蒸餾水定容至1000ｍＬ,貯于棕色瓶中,一周后即可使用。5.1.1.3配制巴比妥緩沖液(ｐＨ=8.6)稱取1.84ｇ巴比妥酸,置于56～60℃水中溶化,然后加入10.3ｇ巴比妥鈉,加蒸餾水定容至1000ｍＬ。5.1.1.4配制0.5%果膠溶液正確稱取0.5ｇ果膠于燒杯中,用巴比妥緩沖液(ｐＨ=8.6)溶解、稀釋定容至100ｍＬ。5.1.2制作果膠酶稀釋倍數(shù)和吸光度關(guān)系曲線分別按表1稀釋倍數(shù)用蒸餾水稀釋果膠酶,將稀釋酶液按4.3.2測(cè)定吸光度值,以果膠酶稀釋倍數(shù)倒數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度(Ａ)為縱坐標(biāo)作關(guān)系曲線(見(jiàn)圖1)。5.1.3結(jié)果和討論由公式(4)、(5)可得出,在酶活相同情況下,吸光度和酶液稀釋倍數(shù)倒數(shù)應(yīng)呈正百分比關(guān)系。圖1為試驗(yàn)測(cè)得果膠酶稀釋倍數(shù)倒數(shù)和其酶活力吸光度值關(guān)系曲線,從中可看出果膠酶稀釋倍數(shù)過(guò)低或過(guò)高全部會(huì)偏離正比線性關(guān)系,尤其在稀釋倍數(shù)過(guò)低情況下。原因可能有以下兩點(diǎn):①依據(jù)米氏學(xué)說(shuō),底物濃度應(yīng)保持足夠大到使酶飽和,達(dá)成最大反應(yīng)速率,酶活值和酶濃度才能成正比。過(guò)高酶液濃度可能使底物濃度相對(duì)不足,而不能滿足這種正比關(guān)系。②依據(jù)朗伯-比耳定律,吸光度和濃度間只在一定范圍內(nèi)有很好正比關(guān)系,酶促反應(yīng)產(chǎn)生高濃度產(chǎn)物和ＤＮＳ絡(luò)合物顏色過(guò)深,會(huì)超出這一范圍產(chǎn)生較大誤差。稀釋倍數(shù)過(guò)高時(shí)吸光度值也偏離朗伯-比耳定律,但仍滿足底物使酶飽和條件,所以產(chǎn)生偏差相對(duì)小得多。果膠溶液配制一定要有足夠大量,但過(guò)大果膠濃度又會(huì)使溶液粘度加大,增加操作誤差。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn),在反應(yīng)30ｍｉｎ條件下確定0.5%果膠濃度,效果最好。將表1最高稀釋倍數(shù)和最低稀釋倍數(shù)吸光度值刪除,對(duì)其它數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到曲線回歸方程為:Ａ=820.72Ｃ(Ｒ2=0.9943)。表明其線性相關(guān)度很好,說(shuō)明當(dāng)酶制劑稀釋液吸光度值在0.2～0.4范圍內(nèi)時(shí),其酶活值有很高正確度。用自產(chǎn)粗酶液進(jìn)行了一樣試驗(yàn),也得到相同結(jié)果(見(jiàn)表2)。

所以,能夠確定果膠溶液濃度為0.5%,控制酶液稀釋倍數(shù)使吸光度值在0.2～0.4范圍內(nèi)。5.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線目標(biāo),也是找到葡萄糖溶液濃度和吸光度最好線性關(guān)系范圍。繪制參考數(shù)據(jù)及結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。由圖2可見(jiàn),在此范圍內(nèi),曲線有很好線性關(guān)系。本測(cè)定方法采取葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,因?yàn)槠咸烟且椎?且價(jià)錢廉價(jià)。用還原糖作為標(biāo)準(zhǔn)曲線,是為了標(biāo)定果膠分解產(chǎn)生還原性醛基量。在公式(5)求酶活公式中,有一項(xiàng)葡萄糖和半乳糖醛酸轉(zhuǎn)換系數(shù),可換算為以半乳糖醛酸計(jì)。所以,不管用哪種還原糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果全部是相同。5.3試驗(yàn)溫度和ｐＨ范圍酶促反應(yīng)全部有最好反應(yīng)溫度和ｐＨ范圍。在最好酶反應(yīng)范圍內(nèi),酶作用活力最高。最好酶反應(yīng)ｐＨ值和溫度范圍是由酶本身性質(zhì)、特點(diǎn)所決定,過(guò)多偏離此范圍會(huì)使酶活性降低甚至失去活性。所以在測(cè)定果膠酶活性時(shí),作用溫度和ｐＨ值要和其最好反應(yīng)條件范圍相一致。最好酶反應(yīng)條件通常會(huì)由酶制劑廠家提供。在紡織領(lǐng)域應(yīng)用果膠酶,通常以堿性果膠酶為主。本試驗(yàn)應(yīng)用就是堿性果膠酶,其最好反應(yīng)條件是溫度45～55℃,ｐＨ范圍8～9。配制果膠酶溶液用巴比妥緩沖液(ｐＨ=8.6),在50℃水浴中進(jìn)行酶促反應(yīng)可取得最好試驗(yàn)結(jié)果。5.4降低試驗(yàn)誤