第三講-量子點熒光探針

第三講量子點熒光探針2量子點概述當半導(dǎo)體材料降至一定臨界尺寸后，電子在三維上的運動受到了限制，表現(xiàn)出量子局限效應(yīng)。這類材料都稱為量子點（quantumdots，QDs）量子局限效應(yīng)導(dǎo)致費米能級附近的電子能級由連續(xù)變?yōu)殡x散能級或能隙變寬，具有類似分子特性的分立能級結(jié)構(gòu)，受激后可以發(fā)射熒光。3量子點又稱為半導(dǎo)體納米晶（nanocrystals，NCs）、半導(dǎo)體納米粒子（nanoparticles，NPs）Ⅳ-Ⅳ族：SiC，SiGe；量子點種類Ⅱ-Ⅵ族：CdSe，CdTe，ZnS，MgSe等；Ⅲ-Ⅴ族：GaAs，InAs，GaSb等；Ⅳ族：Si，Ge；Ⅳ-Ⅵ族：PbSe；單量子點：Au，Pd，Co等；什么是量子點？

量子點是準零維的納米材料，由少量的原子所構(gòu)成。粗略的說，量子點的三個維度的尺寸都在100納米以下，外觀恰似一極小的點狀物，其內(nèi)部電子在各方向上的運動都受到局限，所以量子局限效應(yīng)特別顯著。由于量子局限效應(yīng)會導(dǎo)致類似原子的不連續(xù)電子能級結(jié)構(gòu)，因此量子點又被稱為“人造原子”。科學家已經(jīng)發(fā)明許多不同的方法來制造量子點，并預(yù)期這種納米材料在21世紀的納米電子學上有極大的應(yīng)用潛力。quantumconfinementeffect量子點可用來作激光器的工作物質(zhì)nanoelectronics什么是量子點？若要嚴格定義量子點，則必須由量子力學出發(fā)。電子的物質(zhì)波特性取決于其費米波長。λF

=

2π

/

kF在一般的材料中，電子的波長遠小于材料的尺寸，因此量子局限效應(yīng)不顯著。如果將某一個維度的尺寸縮到小于一個波長，此時電子只能在另外兩個維度所構(gòu)成的二維空間中自由運動，這樣的系統(tǒng)我們稱之為量子阱；如果我們再將另一個維度的尺寸縮到小于一個波長，則電子只能在一維方向上運動，我們稱之為量子線；當三個維度的尺寸都縮到一個波長以下時，就成為量子點了。什么是量子點？由此可見，并非小到100nm以下的材料就是量子點，真正的關(guān)鍵尺寸是由電子的德布羅意波長或平均自由程。一般而言，電子費米波長在半導(dǎo)體內(nèi)較在金屬內(nèi)長得多，例如在半導(dǎo)體材料砷化鎵GaAs中，費米波長約40nm，在鋁金屬中卻只有0.36nm。量子阱、量子線及量子點能級比較關(guān)系示意圖70年代，量子點由于其獨特的光學特性,認為其應(yīng)用主要集中在電子與光學方面。80年代，生物學家已經(jīng)對量子點產(chǎn)生了濃厚的興趣，但由于它的熒光量子產(chǎn)率低，工作集中在研究量子點的基本特性方面。1997年以來，量子點制備技術(shù)的不斷提高,量子點已越來越可能應(yīng)用于生物學研究。量子點可作為生物探針是從1998年AlivisatosAP.和ChanWC兩個研究小組開始，此后量子點的功能進一步被發(fā)現(xiàn)、推廣，使之成為生物學領(lǐng)域研究的熱點。量子點研究的歷史量子點的制備方法目前，量子點的制備方法主要有以下四種.1.化學溶膠法(chemicalcolloidalmethod)：以化學溶膠方式合成，可制作復(fù)層量子點(multilayered)，過程簡單，且可大量生產(chǎn)。量子點的制備方法2.自組成法(self-assemblymethod)：采用分子束磊晶(molecular-beamepitaxy)或化學氣相沉積(chemicalvapordeposition)過程，并利用晶格不匹配(latticemismatch)的原理，使量子點在特定基材表面自聚生長，可大量生產(chǎn)排列規(guī)則的量子點。在GaAs基材上以自組成法生長InAs量子點的STM影像

量子點的制備方法3.微影蝕刻法(lithography

and

etching)：以光束或電子束直接在基材上蝕刻制作出所要之圖案，由于相當費時因而無法大量生產(chǎn)。以GaAs基材蝕刻窄圓柱式量子點之SEM影像，水平線條約0.5微米

量子點的制備方法4.分閘法(split-gateapproach)：以外加電壓的方式在二維量子井平面上產(chǎn)生二維局限，可控制閘極改變量子點的形狀與大小，適合用于學術(shù)研究，無法大量生產(chǎn)。以分閘法產(chǎn)生GaAs/AlGaAs量子點之SEM影像量子點的制備方法小結(jié)合成方法Top-downBottom-up晶體表面刻蝕組成器件化學制備生物體系標記波長范圍寬，發(fā)射峰尖銳，發(fā)射波長可以通過納米粒子粒徑調(diào)節(jié)，易于自組織14量子點的光學特性寬吸收峰：能吸收所有比它第一發(fā)射波長更短的“較藍”的光。窄發(fā)射峰：具有非常窄且十分對稱的熒光發(fā)射光譜。大斯托克斯位移：消除激發(fā)光和散射光等背景干擾。15光穩(wěn)定性：抵抗紫外、化學物質(zhì)、生理代謝對其的降解。安全：細胞毒性低，可用于活細胞及體內(nèi)研究。高量子效率：熒光強度大，發(fā)光時間長，便于長期跟蹤和保存結(jié)果。16發(fā)射波長尺寸可調(diào)：通過控制量子點大小或組成合成任意所需發(fā)射波長的量子點，達到同時檢測多種指標的要求。獨特優(yōu)越的光學、電子和表面可修飾性！1718量子點的應(yīng)用光電子學方面的應(yīng)用：電致發(fā)光的光電子器件80s后期，生物學家開始關(guān)注量子點在生物學方面的應(yīng)用；1998年，Alivisatos和Nie研究小組的工作：半導(dǎo)體量子點在生物學研究的應(yīng)用取得重大突破。量子點在生物上的應(yīng)用(A)Excitation(dashed)andfluorescence(solid)spectraoffluorescein;(B)Atypicalwater-solublenanocrystalsampleinPBS傳統(tǒng)熒光素量子點激發(fā)光-虛線；發(fā)射光-實線；半峰高寬度：67nmvs.32nm；10%峰高寬度：100nm

vs.

67nm；量子點光譜優(yōu)點：

無紅外延伸，連續(xù)、寬激發(fā)譜廣激發(fā)譜，窄發(fā)射譜發(fā)射光波長易調(diào)節(jié)染色穩(wěn)定性22M.Bruchez,M.Moronne,P.Gin,Weiss,A.Alivisatos.Science.1998,281:2013-2016.采用兩種QDs標記3T3小鼠纖維原細胞。一種發(fā)綠色熒光（2nm）：經(jīng)TEOS、尿素及乙酸作用后，對細胞核具有很強親和力；一種發(fā)紅色熒光（4nm）：表面經(jīng)生物素修飾后，與親和素修飾的肌動蛋白絲發(fā)生特異性吸附。QDs用于熒光生物標記23QDs用于非同位素標記生物分子的超靈敏檢測QDs表面連接上巰基乙酸（HS-CH2COOH),從而使量子點既具有水溶性，還能與生物分子（如蛋白質(zhì)、多肽、核酸等）結(jié)合，然后通過光致發(fā)光檢測出QDs，從而使生物分子識別一些特定的物質(zhì)。CdSe：發(fā)光核心Zns：包殼它們是在有機溶劑中制備的，不溶于水，無生物親和性。巰基集團作用：S與ZnS包殼中Zn原子結(jié)合，而有機集團與蛋白質(zhì)結(jié)合，這樣量子點探針就溶于水，且有生物親和性了。24ABCoriginalQDsmercapto-solubilizedQDsQD-IgGconjugates轉(zhuǎn)鐵蛋白與量子點共價交聯(lián)，在受體的介導(dǎo)下發(fā)生內(nèi)吞作用，轉(zhuǎn)移至HeLa細胞中，證明連接的量子點仍具有生物活性。裸量子點結(jié)合巰基結(jié)合了巰基蛋白質(zhì)25兩個創(chuàng)新點：發(fā)揮QDs的水溶性將QDs與生物分子的偶聯(lián)單個波長可激發(fā)所有的量子點，而不同染料分子的熒光探針需多個激發(fā)波長。應(yīng)用范圍廣：可用于多領(lǐng)域和多儀器多種顏色：顏色取決于量子點的大小，在同一激發(fā)波長下，可發(fā)出多種激發(fā)光，達到同時檢測多種指標的要求。抗光致漂白性安全：細胞毒性低，可用于活細胞及體內(nèi)研究熒光時間長：熒光時間較普通熒光分子長數(shù)千倍，便于長期跟蹤和保存結(jié)果量子點在生物上的應(yīng)用27基于QDs與生物分子間的特異性相互作用構(gòu)建量子點-生物復(fù)合探針特異性靶向作用保持熒光強度及穩(wěn)定性減少其他分子非特異性吸附28量子點的制備Top-downBottom-up晶體表面刻蝕組成器件化學制備生物標記有機相制備水相制備29前驅(qū)體穩(wěn)定劑：巰基乙酸、巰基乙醇、2-硫代二乙醇、左旋半胱氨酸等形成的量子點類型：CdSe傳統(tǒng)核型，CdSe-CdS核-殼型，CdTe-CdS-ZnS核-殼-殼型，Eu摻雜CdSeie：在絕氧的條件下，向以巰基乙酸為穩(wěn)定劑的CdCl2溶液中引入H2Te氣體，通過高溫或微波，使量子點快速成核及生長。陽離子：Zn2+、Cd2+等；陰離子：Te2-、Se2-等。30量子點的表面修飾與生物功能化

1、使用雙功能試劑，與量子點表面金屬離子配合313、對量子點表面進行硅烷化處理，并嵌入可與生物分子連接的官能團2、表面修飾有三正辛基氧化磷（TOPO）的量子點先與雙親聚合物的疏水長鏈以疏水作用力相結(jié)合，再通過聚合物的親水基團與生物分子連接324、在量子點表面修飾帶負電荷的基團，通過電荷作用力與帶正電的生物分子結(jié)合5、將量子點并入帶空隙的微珠或納米級的微球中，形成膠囊，再通過雙功能試劑將微球與生物分子連接33生物成像熒光免疫分析生物芯片生物傳感器基于FRET研究生物分子間作用34WuX,LiuH,LiuJ,NatBiotechnol,2003,21（1）:41-46Wu等將CdSe/ZnS量子點與羊抗鼠IgG或鏈霉素結(jié)合，并將其作為二抗與抗Her2的單體克隆抗體進行免疫反應(yīng)，從而實現(xiàn)乳腺癌細胞的特異性檢測。QDs用于生物成像技術(shù)35a.PEG-coatedCdSe/ZnS量子點標記的小鼠肺部：血管、腫瘤細胞、腫瘤中的血管和淋巴管b.近紅外熒光QDs被前哨淋巴結(jié)吸收。組織成像KimS,LimYT,SolteszEG.Nat.Biotechnol.2004,22:93-9736c.包含各種量子點的不同顏色的微珠被注射到小鼠體內(nèi)用于活體成像d.用連接有抗體的紅色量子點進行小鼠活體內(nèi)前列腺癌細胞的特異性標記和成像XGao,ML.Richard,ShumingNie.Nat.Biotechnol,2004,22:959-960活體成像37QDs用于免疫分析是臨床醫(yī)學上鑒別某些生物標志的重要生物技術(shù)手段。同時分析多種熒光物質(zhì)有機熒光染料？量子點量子點與免疫球蛋白IgG結(jié)合，再捕捉抗原38GoldmanER,ClappA

R,AndersonGP.AnaLChem,2004,76(3):684Goldman等人用四種不同顏色的量子點分別于抗霍亂毒素、蓖麻毒素、志和菌毒素1和葡萄球菌腸毒素B的抗體偶聯(lián)，在一個微孔板上實現(xiàn)了四種毒素的同時檢測。39QDs應(yīng)用于生物芯片技術(shù)

量子點色彩的多樣性滿足了對生物高分子（蛋白質(zhì)、DNA）所蘊含海量信息進行分析的要求將聚合物和量子點結(jié)合形成聚合物微珠，微珠可以攜帶不同尺寸（顏色）的量子點，被照射后開始發(fā)光，經(jīng)棱鏡折射后傳出，形成幾種指定密度譜線（條形碼），這種條形碼在基因芯片和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)中有光明的應(yīng)用前景。40CdSe/ZnS與有機磷水解蛋白（OPH）通過靜電作用偶聯(lián)，測定對氧磷。QDs應(yīng)用于生物傳感器41XJi,JZheng,K.R.Vipin,M.L.Roger.J.Phys.Chem.B,2005,109,3793-379942QDs基于FRET研究生物分子間相互作用1)能量供體的發(fā)射光譜與能量受體的吸收光譜必須重疊；2)能量供體與能量受體的熒光生色團必須以適當?shù)姆绞脚帕校?)能量供體、能量受體之間必須足夠接近，這樣發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的幾率才會高發(fā)生FRET的條件：43CZhang,L.W.Johnson,Anal.Chem.2009,81:3051–305544SingleQuantumDot-BasedNanosensorforMultipleDNADetection基于單量子點納米傳感器用于多DNA檢測ChunyangZhang,JuanHu.Anal.Chem.2010,82,1921-1927QDs用于DNA檢測45傳統(tǒng)DNA檢測生物傳感器單分子檢測核酸雜交技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)操作復(fù)雜，條件難控制，耗時長，靈敏度受限制雙色重合法雙色熒光交聯(lián)光譜檢測單個靶分子底物，熒光光譜重疊干擾46基于單量子點納米傳感器本文根據(jù)量子點的寬激發(fā)譜帶，窄且對稱性好的發(fā)射譜帶，高量子產(chǎn)率，光穩(wěn)定性好的特點，基于雙色同時檢測法（two-colorcoincidence）以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）檢測法，在均相體系中的單分子水平下多通道檢測HIV-1和HIV-2。納米傳感器是以納米級離子為敏感材料，能夠探測、感受外界的信號、物理條件或化學組成，并將探知的信息傳遞給其他裝置的功能單體或儀器。47twobiotinylatedcaptureprobes：captureprobe1,5'-TAGTAAGAATGTATAGC-3'-TEG-Biontin；captureprobe2，5'-GCAACTAAATTCA-3'-TEG-Biontin。twoalexafluorreporterprobes：reporterprobe1，AlexaFluor488-5'-CTGGGATTAAATAAAA-3'；reporterprobe2，AlexaFluor647-5'-AAAGGACCAGGC-3'。twotargetoligonucleotides：targetDNA1forHIV-1，5'-GCTATACATTCTTACTATTTTATTTAATCCCAG-3'；targetDNA2forHIV-2，5'-TGAATTTAGTTGCGCCTGGTCCTTT-3'。ExperimentalSection48Thehybridizationexperiments：Bufferedsolution（pH=8.0）：100mMtris-HCl、10mM(NH4)2SO4，3mMMgCl2T=40℃,t=30mins,Mixbiotinylatedcaptureprobes,AlexaFluor488-andAlexaFluor647-labeledreporterprobes,andthetargetDNAs.（captureprobes:repoterprobes=1:1）.Atroomtemperature,Addthestreptavidin-coated605-nm-emissionQDs(605QDsc=2.5×10-11M).49Schematicviewoftheexperimentalapparatususedfor

simultaneousdetectionofthephotonsemittedfromthe605QD,Alexa

Fluor488,andAlexaFluor647.Photonsemittedfromthe605QD,

AlexaFluor488,andAlexaFluor647wereseparatedbythree

dichroicmirrorsandetectedbythreeavalanchephotodiodes(APDs),

respectively.50Thenormalizedabsorptionandemissionspectraofthe

605QD,AlexaFluor488,andAlexaFluor647.Blueline,absorption

spectrumofAlexaFluor488;greenline,emissionspectrumofAlexa

Fluor488;blackline,absorptionspectrumofthe605QD;magenta

line,emissionspectrumofthe605QD;cyanline,

bsorptionspectrum

ofAlexaFluor647;redline,emissionspectrumofAlexaFluor647.51ResultsandDiscussion52RepresentativetracesofthefluorescenceburstsfromAlexaFluor488,the605QD,andAlexaFluor647detectedwithasingle

QD-basednanosensorsformultipleDNAdetectioninamicrofluidicflow.The

fluorescencesignalsofAlexaFluor488wereshowningreen.Thefluorescencesignalsofthe605QDwere