內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷專家講座

Microvesiclesderivedfromendothelialprogenitorcellsprotectkidneyfromischemia-reperfusioninjurybymicroRNA-dependentreprogrammingofresidentrenalcell主講人：JACKY內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第1頁(yè)文件介紹起源：KidneyInternational;publishedonline11April2012.

作者：VincenzoCantaluppietal.科研機(jī)構(gòu)：UniversityofTorino,Torino,Italy.內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第2頁(yè)內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第3頁(yè)文件摘要內(nèi)皮前體細(xì)胞經(jīng)過(guò)旁分泌含有逆轉(zhuǎn)急性腎損傷作用。從前體細(xì)胞分泌微囊泡經(jīng)過(guò)mRNA水平轉(zhuǎn)移激活了內(nèi)皮細(xì)胞血管形成程序。微囊泡中RNA富含miRNA，這些miRNA能夠調(diào)整細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管形成、抗凋亡。缺血再灌注后，經(jīng)過(guò)靜脈注射微囊泡，這些囊泡主要集中在管周毛細(xì)血管、腎小管上皮細(xì)胞。經(jīng)過(guò)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖，降低凋亡和白細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)腎小管形態(tài)和功效保護(hù)。微囊泡也能經(jīng)過(guò)抑制毛細(xì)血管稀疏化、腎小球硬化和管周間質(zhì)纖維化來(lái)延遲緩性腎損傷進(jìn)程。這些微囊泡保護(hù)作用在經(jīng)過(guò)RNase預(yù)處理、經(jīng)過(guò)敲除祖細(xì)胞Dicer基因來(lái)非特異性抑制祖細(xì)胞中miRNA產(chǎn)生、經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染特異性miR-antagomirs來(lái)使促血管生成miR-126和miR-296表示降低。所以，內(nèi)皮祖細(xì)胞起源微囊泡經(jīng)過(guò)它們RNA成份來(lái)保護(hù)腎臟免受缺血造成急性損傷，這些RNA成份中miRNA有利于低氧環(huán)境下腎固有細(xì)胞開(kāi)啟增殖程序。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第4頁(yè)EPC內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞，亦稱為成血管細(xì)胞(angioblast)，在生理或病理原因刺激下，可從骨髓動(dòng)員到外周血參加損傷血管修復(fù)。1997年，Asahara等首次證實(shí)循環(huán)外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞,并將其命名為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。近年來(lái)研究顯示,內(nèi)皮祖細(xì)胞在心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮主要作用，并為缺血性疾病研究治療提供了新思緒。EPCs生物學(xué)特征和治療作用研究成為這一領(lǐng)域新熱點(diǎn)。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第5頁(yè)MVMicrovesicle（MV）是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞在正常和病理狀態(tài)下都會(huì)分泌直徑在30~1000nm之間微小囊泡。多數(shù)研究者用MV來(lái)指代含有細(xì)胞間信號(hào)傳遞功效囊泡。細(xì)胞把特異生物活性分子如蛋白質(zhì)、miRNA等包裹到MV中，被運(yùn)輸?shù)綄?duì)應(yīng)受體細(xì)胞并調(diào)整受體細(xì)胞生物功效。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第6頁(yè)

EPC起源MV一些基本特征內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第7頁(yè)miRNA微小核糖核酸(microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA)，是一類非編碼由19-24個(gè)核苷酸組成小分子單鏈RNA,它們能夠與靶mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)而起作用，使mRNA降解或抑制其翻譯，從而參加各種主要生理和病理過(guò)程。miRNA可穩(wěn)定存在于血清血漿等體液中，有可能作為一個(gè)新生物標(biāo)志物用于臨床，有助診療疾病或者判斷疾病預(yù)后和復(fù)發(fā)情況，指導(dǎo)用藥和選擇治療方式。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第8頁(yè)miRNA產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制miRNA產(chǎn)生及其作用方式視頻內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第9頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)內(nèi)皮祖細(xì)胞釋放微囊泡對(duì)腎臟急性缺血再灌注損傷動(dòng)物模型是否有保護(hù)效應(yīng);微囊泡對(duì)低氧誘導(dǎo)腎臟上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用機(jī)制研究？?jī)?nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第10頁(yè)試驗(yàn)材料及方法Wistar雄性大鼠EPCs和fibroblast細(xì)胞RNase;siRNA;anti-miR-126antagomiRS;anti-miR-296antagomiRS;anti-Dicerpolyclonalantibody;內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第11頁(yè)試驗(yàn)分組內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第12頁(yè)BioanalyzerRNAprofileEPCEPCMV內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第13頁(yè)miR-126andmiR-296含量比較EPCEPCMVFIBROFIBROMV內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第14頁(yè)經(jīng)過(guò)不一樣處理后miR-126和miR-296含量?jī)?nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第15頁(yè)試驗(yàn)過(guò)程1、按照分組制作模型，馬上尾靜脈注射MV?！?、試驗(yàn)第二天，全部組，每組處死6只大鼠取樣本分析。↓3、試驗(yàn)第七天，全部組，每組處死6只大鼠取樣本分析?！?、試驗(yàn)第180天，前四組，每組處死6只大鼠取樣本分析。IRI模型：右腎切除+左腎腎蒂夾閉45min。MV經(jīng)由尾靜脈注射，30微克。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第16頁(yè)試驗(yàn)結(jié)果EPC起源MV和成纖維細(xì)胞起源MV特征及其比較EPC起源MV對(duì)腎臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用EPC起源MV對(duì)體外培養(yǎng)低氧管周內(nèi)皮細(xì)胞（TEnCs）和腎小管上皮細(xì)胞(TEpCs)影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第17頁(yè)EPC起源MV對(duì)腎臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用血肌酐和尿素氮水平病理學(xué)形態(tài)檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡及增殖檢測(cè)長(zhǎng)久影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第18頁(yè)血清肌酐和尿素氮內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第19頁(yè)MV注射后在體內(nèi)分布情況內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第20頁(yè)病理檢驗(yàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第21頁(yè)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第22頁(yè)細(xì)胞增殖率檢測(cè)（a、cBrdu；b、dPCNA）內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第23頁(yè)細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL法）內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第24頁(yè)炎細(xì)胞浸潤(rùn)內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第25頁(yè)長(zhǎng)久結(jié)果（六個(gè)月后）內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第26頁(yè)小結(jié)以上試驗(yàn)結(jié)果表明：EPC起源MV對(duì)IRI模型含有保護(hù)作用。能使血肌酐、尿素氮降低，細(xì)胞增殖加緊、凋亡降低。長(zhǎng)久結(jié)果還能降低間質(zhì)纖維化，促進(jìn)血管形成。去除MV中miRNA-126/296無(wú)此效果。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第27頁(yè)這些MV是到血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞呢如何定位？?jī)?nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第28頁(yè)不一樣表面蛋白分子對(duì)MV內(nèi)化影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第29頁(yè)不一樣起源MV內(nèi)化區(qū)分內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第30頁(yè)mvproteinsurfaceexpressionEPC-derivedMVFibroblast-derivedMV內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第31頁(yè)proteinsurfaceexpression區(qū)分內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第32頁(yè)EPC-derivedMV對(duì)低氧環(huán)境培育TEnCs細(xì)胞凋亡、血管生成影響TUNEL法檢測(cè)TEnDs凋亡毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)檢測(cè)促血管生成作用內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第33頁(yè)EPC-derivedMV對(duì)低氧環(huán)境培育TEnCs促血管生成相關(guān)基因表示影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第34頁(yè)EPC-derivedMV對(duì)低氧環(huán)境培育TEpCs細(xì)胞凋亡影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第35頁(yè)EPC-derivedMV對(duì)低氧環(huán)境培育TEpCs凋亡相關(guān)基因表示影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第36頁(yè)內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第37頁(yè)結(jié)論注射含有miR126/296MV大鼠血肌酐和尿素氮水平顯著降低；顯著改進(jìn)腎小球、腎小管和腎間質(zhì)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；能使小管壞死降低、管型生成降低；而且能夠抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖；降低炎細(xì)胞浸潤(rùn)。長(zhǎng)久結(jié)果是：血肌酐水平下降，間質(zhì)纖維化降低和血管生成增多，不論是短期結(jié)果還是長(zhǎng)久結(jié)果，都顯示出miRNA126/296對(duì)IRI模型形態(tài)學(xué)和功效學(xué)保護(hù)作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第38頁(yè)L-selectin是介導(dǎo)MV內(nèi)化主要表面蛋白分子。含有miR126/296MV內(nèi)化后，能夠使凋亡相關(guān)基因表示下調(diào)，抑制上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，血管形成相關(guān)基因表示上調(diào)，促進(jìn)血