臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)量保證+課件

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的

質(zhì)量保證衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratories●為一產(chǎn)品或服務(wù)滿足特定質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計(jì)劃的和系統(tǒng)的措施。質(zhì)量保證(QualityAssurance,QA)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratories室內(nèi)質(zhì)量控制

(InternalQuality

Control,IQC)的概念●由實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，

連續(xù)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的

—項(xiàng)工作?！?/p>

可概括為：(1)執(zhí)行者：實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員；(2)

目的：監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室測定的重復(fù)性；(3)功能：

決定了當(dāng)批測定的有效性，報(bào)告可否發(fā)出。是對(duì)實(shí)驗(yàn)室測定的即時(shí)性評(píng)價(jià)。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinical

Laboratorien室間質(zhì)量評(píng)價(jià)

(ExternalQualityAssessment,EQA)●

為客觀比較一實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果與靶值的差異，由外單位機(jī)

構(gòu)

，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，

發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性。這是對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作和實(shí)驗(yàn)方法的回顧性評(píng)價(jià)，而不是用來決定在實(shí)時(shí)的測定結(jié)果的可接受性。當(dāng)EQA

用來為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒?yàn)室認(rèn)證的目的而評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，常描述為實(shí)

驗(yàn)室能力驗(yàn)證

(Proficiency

testing,PT)。在以前的文獻(xiàn)

中

，EQA

常描述室間質(zhì)量控制。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinical

Laboratorien批(Run)●

在相同條件下所獲得的一組測定。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories●

正態(tài)分布(Gaussian

distribution)

當(dāng)一

質(zhì)控物用同一方法在不同的時(shí)間重復(fù)多

次測定，當(dāng)測定數(shù)據(jù)足夠多時(shí)，如以橫

軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中

相應(yīng)測定值的個(gè)數(shù)，則可得到一個(gè)兩頭

低，中間高，中為所有測定值的均值，

左右對(duì)稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分

布，又稱高斯分布。定

義衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenter

ForClinical

Laboratories正態(tài)分布的基本統(tǒng)計(jì)學(xué)含義可用均數(shù)(X)

、

標(biāo)

準(zhǔn)差

(s)和概率來說明。()X-3S

X+25

x-S

X

X+s

X+3S●

標(biāo)本收集：選擇測定項(xiàng)目、標(biāo)本收集和保存?！?/p>

實(shí)驗(yàn)室測定：標(biāo)本接收、貼標(biāo)簽、樣本處理、核酸擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測、測定的有效性和臨床診療

價(jià)值。●

報(bào)告和解釋：結(jié)果發(fā)出、結(jié)果解釋和臨床管理。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)測定步驟衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratories質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)之間的關(guān)系患者圖1

.

臨床檢馬驗(yàn)中涉及的各-

步驟及其與質(zhì)量控制的關(guān)系QAEQA標(biāo)

本

接

收測

定

的

有

效

性

i臨

床

診

療

價(jià)

值貼上特定的實(shí)馬驗(yàn)室標(biāo)簽

測

定備

測

來保

擇者本本結(jié)果發(fā)

出

結(jié)

果

解

釋

臨

床

管

理標(biāo)

本

收

實(shí)

驗(yàn)

室轅晷

解釋定

集存選患標(biāo)標(biāo)項(xiàng)

目IQC集●標(biāo)本收集●標(biāo)本保存●標(biāo)本運(yùn)送臨床標(biāo)本收集、運(yùn)送、保存及其質(zhì)量控制衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratories標(biāo)本收集

●標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測結(jié)果的影響●

標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備●標(biāo)本的類型和采集量●

采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)●采樣及運(yùn)輸容器●

標(biāo)本采集中的防污染衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratories●在疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都可能會(huì)給出假陰性結(jié)果。標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測結(jié)果的影響衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories●血液標(biāo)本采集●分泌物標(biāo)本：采集部位的清潔消毒

可去掉污染的微生物或其它雜物，

但應(yīng)適度，過度清潔消毒有可能會(huì)

去掉或破壞靶微生物，故標(biāo)本采集

部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員

進(jìn)行。標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

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Clinical

Laboratorien標(biāo)本的類型和采集量●標(biāo)本的類型：血清(漿)、分泌物、痰、

糞便、尿和腦脊液等?！?/p>

標(biāo)本的采集量：應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。

一般來說，如果標(biāo)本的量對(duì)病原體培

養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸

提取及其后的擴(kuò)增檢測。●對(duì)于定量測定來說，對(duì)標(biāo)本的收集要衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratorien求更為精確?！穹置谖?、痰：評(píng)價(jià)內(nèi)容包括細(xì)胞組成，

所需類型細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。評(píng)價(jià)方法：包括肉眼觀察，顯微鏡下觀察

和化學(xué)分析等。采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)●血清(漿)標(biāo)本：溶血、脂血等；衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

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Clinical

Laboratories采樣及運(yùn)輸容器●標(biāo)本的采集材料如棉簽應(yīng)為一次性使

用；●采樣及運(yùn)輸容器應(yīng)為密閉的一次性無

菌裝置；●采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關(guān)試

劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測過程造衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratorien成干擾?！癫杉幸貏e注意污染，防止混入

操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等；●如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，

以使可能存在的RNase

失活。標(biāo)本采集中的防污染衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenter

ForClinical

Laboratorien標(biāo)本保存●靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶

的作用而迅速降解，因此標(biāo)本的

保存對(duì)于核酸擴(kuò)增測定的有效性

極為重要?！袷褂肎ITC作為穩(wěn)定劑保存標(biāo)本，

標(biāo)本可在室溫下穩(wěn)定約7天。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratorien標(biāo)本保存

●

臨床體液標(biāo)本長期保存應(yīng)在-70℃下?！?/p>

如為提取核酸后用于DNA

擴(kuò)增分析的樣

本，可于10mmol/L

Tris,1mmol/LEDTA(pH7.5～8.0)

緩沖液中4

℃下保存。●用于RNA

擴(kuò)增分析的樣本，則應(yīng)于上述

緩沖液中-80℃或液氮下保存?！窈怂岬囊掖汲恋砦飫t可于-20℃下保存。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

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Clinical

Laboratories標(biāo)本運(yùn)送●樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢

測實(shí)驗(yàn)室?！?/p>

樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用

于DNA測定的EDTA抗凝血等，則可在室

溫下運(yùn)送或郵寄。●

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對(duì)各

種臨床樣本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

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Clinical

Laboratories臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)量控制

●測定前的質(zhì)量控制●核酸樣本的制備及其質(zhì)量控制●統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制●質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratories測定前質(zhì)量控制●實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理●理想的試劑和操作方法●人員培訓(xùn)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratories●臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充分合理

的空間、良好的照明和空調(diào)設(shè)備；●實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備應(yīng)保養(yǎng)良好，實(shí)驗(yàn)用品

要達(dá)到相應(yīng)的要求。加樣器的校準(zhǔn)?

帶

濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢?離心機(jī)?熱循

環(huán)儀?水浴箱和/或恒溫干浴儀?酶標(biāo)儀和洗板機(jī)?衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratorien實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理

產(chǎn)

物

分

析區(qū)空氣流向擴(kuò)增區(qū)空氣流向標(biāo)

本

制

備區(qū)空氣流向試

劑

準(zhǔn)

備區(qū)空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)A

衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

CenterForClinical

Laboratorien產(chǎn)

物

分

析區(qū)空氣流向擴(kuò)增區(qū)空氣流向標(biāo)

本

制

備區(qū)空氣流向試

劑

準(zhǔn)

備區(qū)空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)B衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

CenterForClinical

Laboratorien“十六字口訣”衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratories●

各區(qū)獨(dú)立●

注意風(fēng)向●

因地制宜●

方便工作核酸擴(kuò)增檢測實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則擴(kuò)增區(qū)門產(chǎn)物分析區(qū)門擴(kuò)

增

及

產(chǎn)

物分析區(qū)門外走廊

門標(biāo)本制備區(qū)

試劑準(zhǔn)備區(qū)門門

外走廊

門衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

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Clinical

Laboratorien標(biāo)本制備區(qū)門試劑準(zhǔn)備區(qū)AB門標(biāo)本制備區(qū)空氣流向

門擴(kuò)

增

及

產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向門空氣流向試劑準(zhǔn)備區(qū)門衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratorien擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向其他實(shí)驗(yàn)室試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向其他實(shí)驗(yàn)室

其他實(shí)驗(yàn)室走廊走廊其他實(shí)驗(yàn)室空氣流向標(biāo)本制備區(qū)其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinical

Laboratorien其他實(shí)驗(yàn)室走廊其他實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories標(biāo)本制備區(qū)空氣流向+

門擴(kuò)

增

及

產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向++門空氣流向試劑準(zhǔn)備區(qū)門空氣流向

走廊空氣流向+

其他實(shí)驗(yàn)室標(biāo)

本

制

備區(qū)物勢積音空氣流向++其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室其他實(shí)驗(yàn)室試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向其他實(shí)驗(yàn)室門緩沖間

緩沖間工作流向衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratorien產(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增區(qū)傳遞窗空氣流向空氣流向緩沖間專用走廊標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞窗

傳遞窗空氣流向空氣流向“無基因”或

“無核酸”概念的重要性衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinical

Laboratorien失控標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)失敗如靶溫度或溫度差異超出允許范圍待測孔未出現(xiàn)擴(kuò)增，檢測溫度打印程序不對(duì)不符合要求不符合要求不符合要求衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)控方法儀器校驗(yàn)實(shí)驗(yàn)熱電偶監(jiān)測溫度擴(kuò)增功能檢測程序打印校準(zhǔn)溫度檢測預(yù)防性維護(hù)及校準(zhǔn)頻

度當(dāng)儀器移動(dòng)時(shí)每月一次每4個(gè)月一次每次測定時(shí)

每年2次每次實(shí)驗(yàn)每年2次基因擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控加樣器水浴箱酶標(biāo)儀儀器設(shè)備擴(kuò)增儀NationalCenterForClinicalLaboratories帶濾芯吸頭的使用及質(zhì)檢●首先制備一個(gè)含1～2%甘油及色素(如甲基橙)的水溶液，如果吸頭

的最大體積為100

μl,則將加樣器吸

取體積調(diào)至110～120

μl,

再套上吸

頭后吸取上述有色液體。如果吸頭質(zhì)量好，則有色液體不應(yīng)出現(xiàn)在濾芯之上，否則說明濾芯不嚴(yán)。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratorien●離心管PCR

抑制物質(zhì)檢●其他核酸提取用離心管質(zhì)檢衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories●一是使用一種熱電偶探針、微伏轉(zhuǎn)換器和自動(dòng)圖示記錄

儀組成擴(kuò)增加熱模塊孔內(nèi)溫度監(jiān)測記錄系統(tǒng)，當(dāng)孔間溫

度變異超出1℃時(shí)，其可測出來?！窬唧w做法是將裝有TE

緩沖液并上加石蠟油的擴(kuò)增反應(yīng)管

放置于擴(kuò)增儀各孔中，熱電偶探針透過擴(kuò)增反應(yīng)管蓋插

至緩沖液中，然后按程序進(jìn)行一個(gè)常規(guī)的PCR擴(kuò)增，加

熱模塊如為96孔，則至少要測定12孔不同位置孔內(nèi)的溫

度，在整個(gè)擴(kuò)增過程中，可移動(dòng)熱電偶探針至上述不同

孔中監(jiān)測溫度，但每一孔內(nèi)溫度監(jiān)測至少要有一個(gè)擴(kuò)增擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性

的檢測方法衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories周期。擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性

的檢測方法●第二種方法并非直接測定孔內(nèi)溫度，而是通過

擴(kuò)增功能來間接獲知孔間的均一性，即將加有

一已知的含一定濃度的陽性質(zhì)控樣本的擴(kuò)增反

應(yīng)管置于擴(kuò)增儀各孔中按常規(guī)進(jìn)行擴(kuò)增檢測，

觀察結(jié)果的一致性程度，如果有某一個(gè)或幾個(gè)

孔結(jié)果有問題，則應(yīng)確定這一個(gè)或幾個(gè)孔是否

會(huì)重復(fù)性地得到假陰性結(jié)果，如果是，則表明

相應(yīng)孔的熱傳導(dǎo)有損壞。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

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Clinical

Laboratories●試劑盒的質(zhì)檢●定量測定的精密度是測定組成步驟的變

異和的平方根(SD)=√

SD2+SD2+SD2+

…

…上式中SDa

、SD?

、SD.是步驟a

、b

、c

等

(例如試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測等)的標(biāo)準(zhǔn)差理想的試劑和操作方法衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinical

Laboratorien理想的試劑和操作方法●改善測定精密度的措施必須首先

著重在最不精密的步驟上，應(yīng)對(duì)

試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本收集、核酸提取、

測定方法和儀器操作寫出“標(biāo)準(zhǔn)

操作程序”(SOP)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratorien●

質(zhì)量手冊(cè)●

質(zhì)量體系程序文件●

標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)

(相關(guān)記錄表格、報(bào)告

)文件內(nèi)容按確定的質(zhì)量方針和目標(biāo)以及

適用的相關(guān)認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)描述質(zhì)量體

系描述為實(shí)施質(zhì)量體系要素所涉

及到的各職能部門的活動(dòng)詳細(xì)的技術(shù)作業(yè)文件所量手冊(cè)(辰次A)質(zhì)量體系程序程序文件(E

次BD標(biāo)準(zhǔn)崗作程序，記錄表格，很告節(jié)(E

次C)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的建立衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

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Clinical

Laboratories●SOP

:

形式，缺乏可操作性●記錄：檢查型。多而雜?！褓|(zhì)控：形式或沒有●分析：缺乏。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

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Clinical

Laboratories存在問題實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的內(nèi)涵●寫你所應(yīng)做的●做你所寫的●記錄你已做的●分析你已做的衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories把解上作商單的事做野就是不簡單把每一件半凡的事做好就是不平凡A#A

序汪中求若細(xì)節(jié)Derailis

thekey

of

succerr決定成敗新華出版社●看得見的●看不見的衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

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For

Clinical

Laboratories衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratorien衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

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Clinical

Laboratorien●思維習(xí)慣與行為習(xí)慣●羅馬不是一天建成的(Romewas

not

built

ina

day)●

好習(xí)慣是生產(chǎn)力●習(xí)慣即命運(yùn)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

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Clinical

Laboratories質(zhì)量體系文件的三大特性●法規(guī)性、唯一性和適用性?！穹ㄒ?guī)性：是指文件一旦制定完成并批準(zhǔn)實(shí)施，就必須認(rèn)真

執(zhí)行，按照相應(yīng)的文件去完成日常檢驗(yàn)工作，也就是前面所說的做你所寫的。并且文件的修改不能隨意，只能按規(guī)

定的程序進(jìn)行?！裎ㄒ恍裕簞t是指(1)一個(gè)實(shí)驗(yàn)室只能有一個(gè)質(zhì)量體系文件

系統(tǒng)；(2)一項(xiàng)檢驗(yàn)活動(dòng)只能有唯一的操作程序；(3)一項(xiàng)規(guī)定只能有唯一的理解，不產(chǎn)生歧義；(4)只能使

用文件的有效版本，無效版本在實(shí)驗(yàn)室的任何地方都不能

使用。●適用性：是指質(zhì)量體系文件無統(tǒng)一格式；無標(biāo)準(zhǔn)文本；怎

么做怎么寫，切合實(shí)際，具有可操作性，不拘一格。所有

文件的規(guī)定均應(yīng)保證在臨床實(shí)際檢測工作中能完全做到。

當(dāng)發(fā)現(xiàn)文件有不適合情況時(shí)，則應(yīng)立即按規(guī)定程序?qū)ξ募M(jìn)行修改。

National

Center

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Cliien心nicalLaborat部臨床檢驗(yàn)SOP

等于試劑盒說明書嗎?衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratoriesXXX單位XXX實(shí)驗(yàn)室XXX標(biāo)準(zhǔn)操作程序編號(hào)：啟用日期：版本：第

頁

共

頁編寫人審核人批準(zhǔn)人一目的：二適用范圍：三職責(zé)或責(zé)任人：四(方法原理)五

(

檢測設(shè)備和試劑)六(所需的環(huán)境條件)七操作步驟：1.2.3.五、本操作程序變動(dòng)程序：六、相關(guān)的文件七、相關(guān)的記錄表格和報(bào)告怎樣編寫SOP?National

Center

ForTC生lin部iclao驗(yàn)ratri心en●

誰來做(Who):

責(zé)任人●

做什么(

What):適用范圍●

何時(shí)

(When):

適用范圍●

何地

(Where):

適用范圍●

為什么做

(Why):

目的●

如何做

(How):

操作步驟SOP(5W

和1H)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心National

Center

For

Clinical

Laboratories聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR

反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)

PCR

進(jìn)程，最

后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在實(shí)時(shí)熒光定量

PCR反應(yīng)中，引入了一種

熒光化學(xué)物質(zhì)，熒光物質(zhì)有兩種：熒光探針和熒光染料。我們目前是使用TaqMan熒光探針的

檢測原理：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核

苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的

熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq

酶的5'-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)

告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA

鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加【圖1】0這樣就可以通過熒光強(qiáng)度

變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。Ttritten

b制人Date日期：20100120Effective

Date生效日期：Distribution

Scope發(fā)放范國：Gene

Lab臨床基固擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)室Reviewed

by審核者：Approved

b批準(zhǔn)人Dooment

Anmually

Raviewing文件年度審核Reviewed

by審核者：Reviemed

b審核者：Ravieved

b審核者：Date日期Date日期Data日期Reviered

by審核者：Reviewed

by審核者：Feviewed

by審核者：Date日期Date日期Date日期tPotynotsution2.stranddmpbusmana40Assay項(xiàng)目名稱English英文HBVDNAChinese中文乙型肝炎病毒核酸Me

thod方法聚合酶鏈反應(yīng)Basis

for

method方法依據(jù)衛(wèi)生部《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版(2006年)第七篇第六章第一節(jié)二乙型肝炎病毒(HBV)DNAPCR(ABI7300)檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序1.INFORMATION

FOR

TFSI檢測信息衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

Laboratorien2.AHALYTICALPRINCIPIE檢

測

原

理圖14.Polymongohon

complotedR·Rupoder

9-Ouenchm熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意

位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為

CT

值(thresholdvalue)

。CT

值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的

CT

值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)

數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT

值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)

曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表

Ct值。因此，只要獲得未知樣品的

Ct一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷

產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。

PCR的終產(chǎn)物量與起始模板

量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR

產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始

DNA

拷貝數(shù)。只有在熒

光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，

PCR

產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這

個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量

PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和

CT值【圖2】。圖2值基線o3101衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心rClinicalLaboratorien樣本Cr20循環(huán)數(shù)無模板對(duì)照5

ao值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)【圖三】。Rn+△AnAn-

40045Iypes類型Suggested

types推薦類型血清Preferred

types可接受類型EDTA或枸櫞酸鈉抗凝血漿Volume樣本量0ptimum最佳量1.0

mlMinimum最少量200

ulCollection

Containers收集容器含促凝膠試管或普通試管(不含其它物質(zhì))Transport

containers運(yùn)輸容器帶蓋試管Transport

requirenents運(yùn)輸要求在室溫條件下運(yùn)送(可接受冷凍及冷藏樣本)Stability

&Storage

Requirements

穩(wěn)定性及儲(chǔ)藏要求Room

temperature

室溫8小時(shí)Refriger

atedtemperatumre冷藏溫度(2-8T)3

天-20℃2星期-70℃長期Timing

Considerations時(shí)間要求無Unacceptable

Specimens.Actions

to

Take樣本拒收及采取措施拒絕重度溶血樣本、肝素抗凝的血漿Compromising

Physical

Characteristies

/

Interfering

Factors影響/干擾因素溶血或脂血標(biāo)本可能會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果0ther

Considerations其它條件應(yīng)避免反復(fù)凍融標(biāo)本3.1

Patient

Preparation病人準(zhǔn)備事項(xiàng)Component準(zhǔn)備事頂Details具體內(nèi)容Fasting/Special

Diets禁食/特種次食不要求禁食，但由于明顯的脂濁可干擾反應(yīng)，所以空腹

標(biāo)本較為理想Patient

Preparation病人的準(zhǔn)備事項(xiàng)無Special

Collection

Procedures

樣本采集特殊要求避免溶血，抗凝血標(biāo)本6小時(shí)內(nèi)分離血漿，不抗凝血標(biāo)

本2小時(shí)內(nèi)分離血清衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心ClinicalLaboratorien3.2SpecimenType&Handling樣本類型及處理方法3.SPECDMENREQUIREMENIS樣

本

要

求4.REAGENIS

試

劑Manufacturers

生產(chǎn)廣家艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司Approval

Number

批準(zhǔn)文號(hào)國藥準(zhǔn)字20060017Outline

of

Product

試劑想要Type類型Starage

and

Stability

諸藏及穩(wěn)定性Preparetions

準(zhǔn)備工作核酸提取液1.8

ml×1-20℃

6個(gè)月室溫平衡20minHBV強(qiáng)陽性對(duì)照品100

ul×1-20℃

6個(gè)月室溫平衡20minHBV臨界陽性對(duì)照品100

ul×1-20℃

6個(gè)月室溫平衡20min陰性對(duì)照品100

ul×1-20℃

6個(gè)月室溫平衡20minHBV定量標(biāo)準(zhǔn)品20

ul×1-20℃

6個(gè)月室溫平衡20minAttention注意事項(xiàng)：開啟所有試劑盒(包括校準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品)均需注明開啟日期及開啟人(除該試劑盒一次性全部用完)。每個(gè)試劑盒都應(yīng)貼有下列標(biāo)簽：物質(zhì)名稱、批號(hào)、特殊儲(chǔ)藏說明，開啟人，開

啟日期，開啟后有效期。開啟時(shí)應(yīng)檢查試劑是否存在變色，是否有肉眼可見的細(xì)菌生長跡象、

濁度、沉淀反應(yīng)等，如有則表示該試劑已經(jīng)變質(zhì)或超過保質(zhì)期需要廢棄。5.EQUIPHENI儀器設(shè)備Name名稱Storage

and

Stability

儲(chǔ)藏及穩(wěn)定性Preparetions準(zhǔn)備工作HEV

DN陽性

室內(nèi)質(zhì)控品-20=℃

6個(gè)月室溫平衡20min,使用前需2000rpm離心數(shù)秒HBVDNA陰性

對(duì)照品-20=C

6個(gè)月室溫平衡20min,使用前需2000rpm離心數(shù)秒6.2Frequency質(zhì)控周期每檢測一批次標(biāo)本均需同時(shí)檢測至少一個(gè)濃度水平的陽性質(zhì)控品、陰性對(duì)照品、臨界陽也

對(duì)照品及只含反應(yīng)混合液的空白對(duì)照。6.3CoefficientofVariation

CV變異系數(shù)EQUIPMENT使用的儀器設(shè)備Name名稱Specifications型號(hào)Calibration

methods校準(zhǔn)方式實(shí)時(shí)熒光PCR儀ABI

7300送校備注：“校準(zhǔn)方式”欄填寫送校、自校、檢定、比對(duì)等。6.QUALITYCONTRDL

質(zhì)里控制6.1

ControlsUsed質(zhì)控品衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

Laboratorien不同濃度的質(zhì)控品對(duì)應(yīng)的最大允許變異系數(shù)詳見下表。質(zhì)控品濃度范圍1.0-9.0E+03IU/ml最大允許變異系數(shù)5.56%7.2Frequency定標(biāo)周期每一批次標(biāo)本均需同時(shí)檢測4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品。7.3

Procedure程序分別在相應(yīng)的反應(yīng)管加入4個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(無需進(jìn)行核酸提取過程),同病人標(biāo)本一起上

機(jī)擴(kuò)增分析。7.4Correctiveactionforunacceptablecalibration定標(biāo)失敗處理

應(yīng)采取以下步驟，但不僅限于此：7.4.1

檢查擴(kuò)增程序設(shè)置是否正確。7.4.2檢查試劑和標(biāo)準(zhǔn)品是否過期，如已過期，則替換。7.4.3檢查標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)管中是否含有反應(yīng)混合液。7.4.4核實(shí)儀器的計(jì)劃維修是否均按時(shí)進(jìn)行，如否，則執(zhí)行儀器保養(yǎng)程序。7.4.5重新定標(biāo)。1.0-9.0E+04IU/1

4.1751.0-9.0E+05IU/r3.3351.0-9.0E+06u/t

2.781.0-9.0E+07Iu/z2.3816.4AnalyticMethod分析方法6.4.1陽性質(zhì)控品及陰性對(duì)照品室溫靜置復(fù)融20min后，和樣本同樣檢測。6.4.2將陽性質(zhì)控品檢測結(jié)果取以10為底的對(duì)數(shù)值輸入LIS的質(zhì)控系統(tǒng)中，系統(tǒng)自動(dòng)作圖分析6.4Judgerulesofunacceptablecontrol失控判斷規(guī)則詳見SOP-PCR005-G《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序》6.5Correctiveactionforunacceptablecontrol失控處理詳見SOP-PCR005-G《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序》7.CalibrationProcedure定標(biāo)7.1Standards標(biāo)準(zhǔn)品Name名稱Type類型Traceability瓶原方式Storage

andStability儲(chǔ)藏及穩(wěn)定性Preparetion

準(zhǔn)備工作HBV

DNA定量

標(biāo)準(zhǔn)品20

ul/管溯源于國家技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)的GBW(E)090031所提供的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-20℃

6個(gè)月室溫平衡20min,使

用前振蕩混勻數(shù)秒

并2000rpm離心數(shù)

秒衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

Laboratorien8.PRDCEDURE操作步驟8.1試劑配制8.1.1進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)，開啟冰箱冷凍層取出HBV-DNA檢測試劑盒【圖4】。查看外包裝盒(包括生產(chǎn)批號(hào)、有效

期),無誤后拆開試劑盒，取出核酸提取液、反應(yīng)液及Taq

酶(核對(duì)核酸提取液、HBVPCR反應(yīng)液及Taq酶管上批號(hào)與試劑外包裝盒批號(hào)是否一致)【圖5】,不一致則不可使用，需

更換新的試劑。室溫平衡20min,完全融化后2000rpm離心備用。8.1.2核酸提取液的分裝a.取0

.

5ml

離心管架置于超凈工作臺(tái)內(nèi)(開機(jī)前用紫外線消毒30分鐘),用右手拿起鑷子逐個(gè)將離心管放入

離心管架(注意應(yīng)夾住離心管外壁，

不能碰到管內(nèi)壁),擺放順序?yàn)闄M列從左往右擺，豎列為從上往下隔行排，

離心管個(gè)數(shù)為n(n=樣本數(shù)+對(duì)照品+質(zhì)控品)。完成后將鑷子放回原位【圖6】。b.用移液器準(zhǔn)確吸取核酸提取液

50ul分裝至0.5ml離心管中(左上角

第一排開始，從左往右依次加入)。因

核酸提取液內(nèi)含固體沉淀顆粒物，為

使顆粒均勻分布，故每次取樣時(shí)都要

用移液器反復(fù)吸打3-4次【圖7】。分衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

Laboratorien從左往右擺隔行排列圖6夾住

管

懸

外

部管蓋朝前c.

加完一架后用右手拿鑷子將離心管拿起，左手大拇指和中指夾緊離心管下部，然后用食指將蓋子蓋上，順序?yàn)椋簭挠蚁陆堑谝粋€(gè)開始，從右往左依次蓋上【圖8】。離心管蓋全部蓋完后，通過傳遞窗轉(zhuǎn)移至標(biāo)本處理區(qū)。8.1.3HBV-DNA反應(yīng)液的配制每批需設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照(如同時(shí)檢測低值陽性質(zhì)控品，則無需再檢測臨界陽性對(duì)照)、陽性質(zhì)控品、陽

性標(biāo)準(zhǔn)品。所需每批需配制數(shù)

n=樣本數(shù)+對(duì)照品+陽性標(biāo)準(zhǔn)品+質(zhì)控品，每個(gè)測試反應(yīng)體系配

制如下表a.

每盒HBV-DNA

試劑可檢測32人份，根據(jù)每日需檢測標(biāo)本份數(shù)計(jì)算出每批所需HBV

FCR反應(yīng)液和Taq酶用量(例：有111人份需要進(jìn)行檢測，則有3盒試劑可直接使用10ul

移液器將Taq

酶加入HBV

PCR反應(yīng)液中，另有111-3*32=15人份試劑需將

HBV

PCR反應(yīng)液和Taq

酶使用移液器按反應(yīng)體系比例吸取至1.5ml離心管中配制【圖9】)。b.取出離心后備用的HBV

PCR反應(yīng)液和Taq

酶，按上述要求配制后用旋渦振蕩器振蕩混勻5-10sec,然后再用離心機(jī)2000rpm離心10sec備

用試村HBV

FCR反應(yīng)液Taq酶用量(ul)35.70.3生部臨床檢驗(yàn)中心inicalLaboratorien裝完畢后將移液器量程歸位?！緢D10]。e.從操作臺(tái)面上拿取

HBV-DNA試劑配制盒(可選用空余的200ul

槍頭盒)至超凈工作臺(tái)內(nèi)，打開配制盒并用記號(hào)筆在相應(yīng)的孔位右旁按順序編號(hào)【圖11】0編號(hào)規(guī)則為：樣本擴(kuò)增反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的孔位按相應(yīng)的樣本流水號(hào)編寫、陽性質(zhì)控品反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的孔位編“Q”如有高值則標(biāo)為H,低值為L),陰性對(duì)照品孔位編“-”,臨界陽性對(duì)照對(duì)應(yīng)的孔位編“±”,空白對(duì)照對(duì)應(yīng)的孔位編“B”,1

號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的孔位編“S1”,2

號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的孔位編“S2”,依此類推。d.編號(hào)完畢后，用右手拿起鑷子夾起反應(yīng)管(ABI7300

使用的是八聯(lián)-薄壁反應(yīng)管，鑷子應(yīng)夾住反應(yīng)管外壁，不可接到內(nèi)壁【圖12】)e.

按【圖13】所示方向依次將所有反應(yīng)管(反應(yīng)管數(shù)=n)

隔列擺放到配For衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心ClinicalLaboratorien置盒上。【圖13】8.1.3.7從離心機(jī)中取出已混好Taq

酶的PCR反應(yīng)液，用移液器(量程調(diào)

至36ul),

準(zhǔn)確吸取反應(yīng)液并按從上

到下、從左至右的順序依次加至反應(yīng)

管中，注意：吸頭應(yīng)深入到反應(yīng)管底

部，放液時(shí)應(yīng)緩慢，切勿形成氣泡。

【圖14】。8.1.3.8全部加樣完畢后將配制盒通過傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

8.2標(biāo)本處理8.2.1標(biāo)本、質(zhì)控品及對(duì)照品的處理8.2.1.1從冰箱冷凍室取出

HBVDNA陽性質(zhì)控品陰性對(duì)照品室溫平衡20min待其完全融化。8.2.1.2核對(duì)標(biāo)本和原始申請(qǐng)單的條形碼和檢驗(yàn)項(xiàng)目，無誤后依次粘貼上相應(yīng)的流水號(hào)，如質(zhì)控及對(duì)照8.2.1.3從傳遞窗中取出試劑準(zhǔn)備區(qū)分裝好核酸提取液的離心管架，移至生物安全柜內(nèi)在管蓋上用記號(hào)筆寫上阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3……,陽性質(zhì)控管標(biāo)

隔行排列上“Q”

如有高值則標(biāo)為H,低值為L),

圖

15陰性對(duì)照管標(biāo)上“-”,臨界陽性對(duì)照管標(biāo)上“±”。離心管蓋上標(biāo)記的是1,就表示該管要加入流水號(hào)為P0001的標(biāo)本【圖15】。注意：每個(gè)離心管的編號(hào)方向都應(yīng)朝向

管口開啟的方向?！緢D16】衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

Laboratories8.2.1.4去除標(biāo)本管蓋：將標(biāo)本從前處理取至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，按排列順序依次去除樣本管上的橡膠塞。具體操作為：在生物安全柜中，左手拿起血清管并固定，右手拇指和中指捏緊橡膠塞，右手食指輕輕頂住橡膠塞頂部凹面，逆時(shí)針方向輕輕旋下橡膠塞后廢棄于裝有消毒液的垃圾桶(圖17】注意：手指切勿接觸到血清管口或碰觸到血清，如手套上有血清則需及時(shí)跟換新的手套；待所b.

吸樣完畢后，將樣本管放至另一試管架中(切勿不可將樣本放回原試管架位)【圖19]。圖10c.

再用左手按8.2.1.3所述樣本流圖20新位置原位置發(fā)力方向固定管體8.2.1.5樣本及對(duì)照品的處理：a.左手拿起樣本，用量程為200ul調(diào)至50ul

的移液器準(zhǔn)確吸取樣本

(注：為保證樣本的均一性和吸樣準(zhǔn)

確，每次取樣時(shí)需用移液器將樣本吸

打3-5次；吸樣時(shí)移液器套筒不可接角觸到樣本管內(nèi)壁)【圖18】吸打樣本3-5次套筒不可接觸

樣本管內(nèi)壁圖18衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心For

Clinical

Laboratories有樣本管蓋都去除完畢后，也需更換新的手套。)e.

加樣完畢后棄槍頭于盛有消毒液的垃圾桶中(注：一個(gè)吸頭只能用于

一個(gè)樣本的吸樣，禁止使用一個(gè)吸頭

重復(fù)吸取不同樣本)。同時(shí)蓋上離心

管蓋并放回離心管架(放回的位置需

另起一行，切不可放回原位),繼續(xù)處理下一個(gè)樣本。對(duì)照品和質(zhì)控品同病人樣本一樣處理。【圖22】f.

待一架離心管全部加樣完成后用

振蕩混勻器充分振蕩混勻10-15秒。g.

左手將混勻后的離心管轉(zhuǎn)移至恒

溫金屬浴上(注：離心管需對(duì)稱的放

置在恒溫金屬浴相匹配的孔槽內(nèi)),用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，100℃(誤差不超過±1℃)干浴10min(誤差不超過±30sec)?！緢D23】水號(hào)和離心管編號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系拿起相應(yīng)的離心管，打開離心管蓋(注：單手操作，食指和中指固定離心管，拇指稍向后上方發(fā)力打開管蓋，手指切勿碰到離心管口和管蓋內(nèi)側(cè))【圖20】。d.

管蓋完全打開后，用左手食指、拇指和中指固定離心管，將吸頭中的樣本

全部打入離心管底部，輕輕吸打混勻

3-5次。【圖21】衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

Laboratorien加熱孔與離心管體積相匹配溫度顯示圖23i.將上述離心管按順序?qū)ΨQ放入低溫高速離心機(jī)轉(zhuǎn)子孔內(nèi)，擺放離心管時(shí)要將離心管開口朝內(nèi)，蓋上轉(zhuǎn)子蓋及離心機(jī)蓋后，12,000rpm

離心10mino(注：離心時(shí)需在轉(zhuǎn)子孔內(nèi)放置0.5ml離心管專用適配器X

圖26】。j.待離心結(jié)束后，取出離心管并按編號(hào)順序依次擺放在離心管架上(參照【

圖15】的排列方式)并4℃冰箱保存?zhèn)溆茫蝗舢?dāng)天不使用，則應(yīng)保存在-20℃條件下，使用前置室溫平衡

20min,

再以12,000rpm離心10minoh.十分鐘后(前后不超過半分鐘),右手用鑷子夾起橡皮墊從恒溫金屬

浴中拿出離心管【圖25】干浴時(shí)用離心管架置于加熱的離心管上，防止離心管蓋因加熱爆開導(dǎo)致標(biāo)本間的污染【圖24】衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

Laboratorien圖27b.核對(duì)取樣的離心管上編號(hào)與加樣的反應(yīng)管編號(hào)是否一致，并將上清液全部打入反應(yīng)液中，切勿打到反應(yīng)管壁上?！緢D28】8.2.2加樣操作(在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上操作)8.2.2.1用量程為10ul(先將吸樣量調(diào)至4ul)的移液器依次將樣品、對(duì)照品、質(zhì)控品提取后的上清液及HBV

標(biāo)準(zhǔn)品各4ul加到對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管中。a.準(zhǔn)確吸樣，吸頭浸入上清液的深度≤1mm,注意不要碰到沉淀，移液

器套筒不可碰到離心管蓋和管壁(標(biāo)

準(zhǔn)品應(yīng)先用移液器吸打3-5次以混

勻)【圖27】d.蓋上離心管蓋并放回離心管架(放回的位置為另一行，不可放回原位)【圖29】核對(duì)編號(hào)

是否-

致圖28c.

每加一個(gè)樣本后將吸頭廢棄于盛有消毒液的垃圾桶中，并更換新的吸

頭處理下一樣本。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

Laboratorien套筒不可磁

管蓋、管堆吸頭浸入深度≤1mm待加樣

標(biāo)本已加樣標(biāo)本對(duì)照品、質(zhì)控品

標(biāo)準(zhǔn)品圖298.2.2.3將反應(yīng)管連同試劑配置盒通過傳遞窗傳至擴(kuò)增分析區(qū)。8.3擴(kuò)增分析8.3.1打開擴(kuò)增儀專用電腦，待電腦完全啟動(dòng)進(jìn)入操

作界面后再開啟定量PCR儀主機(jī)電源。a.按壓托盤以打開它【圖31】b.

將反應(yīng)管按順序縱向放置放入反應(yīng)板架(注：在反應(yīng)管總數(shù)不足96個(gè)時(shí)，應(yīng)對(duì)稱的將反應(yīng)管放置在反應(yīng)板袈上，兩邊放置要求盡可能對(duì)稱，可以防止熱蓋下壓時(shí)發(fā)生傾斜，也可以使各反應(yīng)管受力和受熱都比較均勻)【圖32】。c.按壓托盤以關(guān)閉它。8.2.2.2待全部樣本加樣完畢更換手套，左手用鑷子夾起反應(yīng)管蓋的一

側(cè)的延伸段(不要碰到管蓋),然后

用右手大拇指從左往右依次蓋緊管

蓋(不要碰到其他未蓋的反應(yīng)管口)

【如圖30]。從前往后從左往右衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

Laboratorien圖30b.

單擊“新建”,軟件自動(dòng)彈出“Newdocument

wizard”窗口，

A31ay

欄選擇“

StandardCurve(Absolute

Quantitation)”,

Cortane

欄選擇“96-Well

Clear”,

AunMoo欄接

受默認(rèn)的”Standard7300”

。再

點(diǎn)

擊Browse

選擇反應(yīng)程序。【圖34】c.點(diǎn)

擊

Brawse.

進(jìn)

入

Templatar文件夾，選擇并雙擊預(yù)先已經(jīng)按試劑

說明書編好擴(kuò)增程序的“ACONHBV.sdt”反應(yīng)板文件【

圖35】,

回

到“New

document

wizard”窗口，點(diǎn)擊

Firith

進(jìn)入樣本編輯界面。

【圖35】8.3.2擴(kuò)增程序編輯a.在電腦桌面上找到ABI7300運(yùn)行程序，

鼠標(biāo)左鍵雙擊進(jìn)入【圖33】衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心Clinical

LaboratorienAUNHPpostmg白c7區(qū)mn10028白

-DeAxpMb輸入保存名稱

選擇保存類型則擴(kuò)增位置的編號(hào)=樣本流水號(hào)=樣本提取時(shí)的離心管號(hào)=反應(yīng)管載體

的

編

號(hào)

=

1

,

依

此

類

推

；②陰性對(duì)照為-③臨界陽性對(duì)照為+-④質(zhì)控品為Q(高值為H,低值為L)⑤四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品為S1

、S2

、S3

、S4

(

左

鍵雙擊S1彈出WellInspector窗口，

選

中

4

個(gè)

標(biāo)

準(zhǔn)

品

并

在Task選項(xiàng)中選e.編輯完成后，單擊

按鈕，彈跳出SaveAs窗口，在Fe

name.欄填

寫該批次標(biāo)本檢測的唯一名稱(如2009-01-

16第一批樣本檢測名稱就Save酵type

編

輯

為20090116HBV-1),

欄選擇

SDS

Docupentg廣adsl

最后單擊Save

保

存?！緢D37】擇Standard,并在Quantity中填上相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)值)⑥空白對(duì)照為Bo【圖36】衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心ClinicalLaboratoriesd.根據(jù)儀器上反應(yīng)管放置的位置在軟件中對(duì)應(yīng)的孔位上編號(hào)，編號(hào)規(guī)則如下：四

國

四質(zhì)控及對(duì)照編號(hào)

國

面樣本編號(hào)國有目

自ADICON

P0001①樣本流水號(hào)是國59t?ro2009-01-16行口4to006目

;及36準(zhǔn)號(hào)白目目貌日四m自b.

條件設(shè)定單

擊

Ampfication

Plot

窗口。①

選擇

6

Manua

Baselne

調(diào)節(jié)模式，Stat

[oyclo}

選

擇

6

,

End(cyde}

選擇15(也可根據(jù)儀器實(shí)

際情況，兩者在2-15之間變化);②

閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超

過正常陰性對(duì)照品的最高點(diǎn)并進(jìn)入

指數(shù)擴(kuò)增期(可手工上下拖動(dòng)閾值線

)

,設(shè)定好后單擊

Anabve

【圖40】。圖40步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間1137℃2min2195℃5min34094℃20sec60sec①核對(duì)擴(kuò)增程序是否與試劑說明書完全一致②核對(duì)反應(yīng)體積是否正確；③核對(duì)熒光信號(hào)采集時(shí)間是否與試

劑說明書一致。擴(kuò)增程序具體設(shè)置如下：反應(yīng)體積為40ul,熒光信號(hào)采集時(shí)間為“62℃60sec”程序處。e.核對(duì)無誤后，單擊

Slat

二開始運(yùn)行程序，整個(gè)程序運(yùn)行時(shí)間約為1小時(shí)40分鐘。sDSv1.4Therunwsstoopedbytheuser,圖39

oK8.3.3結(jié)果分析a.擴(kuò)增程序運(yùn)行結(jié)束后，軟件出現(xiàn)提示窗口，單擊OK。

【圖39】衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心ClinicalLaboratoriesYnstentf.

單

擊

編輯窗口【圖38】:進(jìn)入擴(kuò)增程序62℃以上幾項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)均達(dá)到要求后，當(dāng)日實(shí)驗(yàn)有效，可以發(fā)放報(bào)告。其中任何一項(xiàng)未達(dá)到要求，須

查找原因，分析該批結(jié)果是否可靠，必要時(shí)重新檢測。b.將原始結(jié)果打印，按編號(hào)對(duì)應(yīng)關(guān)系將所有樣本的結(jié)果輸入LIS系統(tǒng)，同時(shí)該打印件作為原

記錄保存歸檔。9.CAICULATIONS結(jié)

果

計(jì)

算本項(xiàng)目不涉及此條款。10.Repeat

Criteria

and

Resulting復(fù)查標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果報(bào)告10.1Judgmentoftheresult結(jié)果審核a.檢測樣本中1.000E+03IU/ml≤HBVDNA≤1.000E+08IU/ml,測定結(jié)果有效，可直接c.單

擊LStandardCurve

選項(xiàng)，要求①

斜率在-3.0~-4.0之間。②

截距>40③

相關(guān)系數(shù)R2>0.99滿足上述三點(diǎn)說明本次標(biāo)準(zhǔn)曲線符

合要求【圖41】。8.3.4結(jié)果分析a.

單

擊

Resutts

選項(xiàng)，再選擇

Plate

選項(xiàng)，則顯示該批次所有樣本檢測的結(jié)果(以科學(xué)計(jì)數(shù)法方式顯示)【圖42】①

空白對(duì)照及陰性對(duì)照無擴(kuò)增，若

檢測了試劑盒自帶臨界陽性對(duì)照，則

其CT值≤35;②

陽性質(zhì)控品結(jié)果在控；③

標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求；0300Syicns?SSo1Wve

T0007UNWr

dracm0Weefootkkunrt

aros

Wns*b口

酒

回

回

國

口

施

警beoYinshrumemYResnkePuY(EpedaYcamp0nemYpopnc1onPatY

p1!4國

2002

102

1Q四

1

f

e

+

0

0

2

四15se+00s1四22+0o四un當(dāng)國hdt0

100634+0020s0。00日42四3624+002eUhon圖42國四1aei因540e-002四neIU/ml時(shí)，定量結(jié)果小于試劑的檢測下限，報(bào)告為<1.000E+03衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心ClinicalLaboratories報(bào)告。b.樣本檢測結(jié)果<1.000E+03

IU/ml。c.檢測樣本

HBVDNA為

Undet

IU/ml時(shí)，報(bào)告為<1.000E+03

IU/ml。d.

樣本檢測結(jié)果>1.000E+08IU/ml時(shí)，則應(yīng)用HBV

DNA陰性血清將樣本進(jìn)行100-1000倍稀釋后再重新進(jìn)行檢測，并將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)后報(bào)告結(jié)果。e.其他注意事項(xiàng)詳見

S0P-PCR027-G《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室報(bào)告審核標(biāo)準(zhǔn)操作程序》的相關(guān)

要求。10.2

Reference

Ranges參考范圍<1.000E+03IU/ml10.3AMR分析測量范圍1.000E+03IU/ml≤HBV

DNA≤1.000E+08IU/ml10.4

Clinic

Reportable

Range臨床可報(bào)告范圍1.000E+03IU/ml≤HBV

DNA≤1.000E+11IU/ml10.5RepeatCriteria復(fù)查標(biāo)準(zhǔn)詳見

S0P-PCRO27-G《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室報(bào)告審核標(biāo)準(zhǔn)操作程序》和

S0P-LAB014-G《實(shí)

驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果復(fù)查的標(biāo)準(zhǔn)操作程序》中的相關(guān)要求。11.CLNICAL.SIGNIFICANCE臨床意義11.1判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性，HBVDNA是直接反映HBV夏制狀態(tài)及傳染性的最佳指標(biāo)。

11.2PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評(píng)價(jià)隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的檢測技術(shù)的發(fā)展，采用基因

擴(kuò)增技術(shù)(PCR)

檢測對(duì)HBV-DNA進(jìn)行乙肝病毒DNA定性和定量，結(jié)合二對(duì)半檢測結(jié)果，對(duì)

于機(jī)體乙肝病毒感染狀態(tài)尤變異株發(fā)生和病人預(yù)后的評(píng)估更為科學(xué)。11.3觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量直接檢測血清中的HBVDNA是監(jiān)控HBV傳染和

觀察抗病毒藥物療效的最可靠的方法。根據(jù)《2000年拉米夫定臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見》中國慢

性乙型肝炎病人治療的目的主要就是降低血清HBV

DNA,誘

導(dǎo)HBeAg血清轉(zhuǎn)換，使LT

正?；?，改善肝臟組織學(xué)病變，改善疾病癥狀、體征，提高生活質(zhì)量，降低肝硬化和肝癌的發(fā)生

率。同時(shí)血清的

HBVDNA

滴度的動(dòng)態(tài)變化還可在臨床上對(duì)用藥的劑量、用藥時(shí)間以及是否需

要聯(lián)合用藥等提供參考。11.4獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷

HBsAg在血清中的檢出通常在乙肝病毒感染機(jī)體后的2-4月出現(xiàn)，平均為56天左右。而HBVDNA的檢出可以將該所謂“窗口期”提前6-15天，對(duì)于早期診斷和提高輸血安全有著重要的意義。11.5預(yù)測病情、判斷預(yù)后

HBV

DNA的定量檢出對(duì)于病情的預(yù)測和預(yù)后的判斷有著參考意

義。通常HBVDNA持續(xù)陽性超過6個(gè)月的會(huì)轉(zhuǎn)為慢性肝炎?？?HBe陽性患者血清HBVDNA衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心ClinicalLaboratories持續(xù)陽性常提示肝損嚴(yán)重。50%以上抗-HBe陽性慢活肝病人，經(jīng)平均4.5年發(fā)展為肝硬化，常與HBVDNA持續(xù)陽性有關(guān)。11.6器官移植中的作用肝臟器官移植是目前肝硬化晚期治療的唯一方法，但有約86%以上

既往

HBsAg攜帶者術(shù)后HBsAg重新出現(xiàn)。檢測HBVDNA可用于觀察免疫受損患者的HBV

感染

狀況。肝移植后乙肝主要是復(fù)發(fā)，再感染為次要因素。特別是移植前HBV復(fù)制水平高者，復(fù)

發(fā)和再感染的機(jī)率是要更高的。定量檢測HBV

DNA為肝移植術(shù)后的跟蹤觀測具有較好的臨床

價(jià)值。11.7對(duì)阻斷母嬰傳播的監(jiān)測聯(lián)合應(yīng)用高價(jià)免疫球蛋白和乙肝疫苗有效地阻斷母嬰傳播，但

仍有5-10×嬰兒對(duì)疫苗呈低反應(yīng)，熒光PCR

可對(duì)此進(jìn)行監(jiān)測，分析阻斷失敗的原因。12.LIMITATIONSOFMETHDD方

法

限

制12.1InterferingSubstances干擾物質(zhì)12.1.1嚴(yán)重溶血。12.1.2肝素抗凝。12.

1.3脂濁12.2Sensitivity

and

specificity靈敏度和特異性

檢測下限1.000E+03IU/ml13.SAFETY

安全須知13.1S0P-LAB010-G《實(shí)驗(yàn)室消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序》13.2SU0004-G《檢驗(yàn)工作人員安全防護(hù)制度》13.3SU0006-G《意外事故處理制度》14.References

相關(guān)文件14.1

EF3002-G《實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)》14.2EF0012-G《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程-第三版》14.3SOF-PCR005-字母代碼《基因?qū)嶒?yàn)室室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序》14.4S0P-LAB014-G《實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果復(fù)查的標(biāo)準(zhǔn)操作程序》14.5S0F-PCR027-G《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室報(bào)告審核標(biāo)準(zhǔn)操作程序》15.Records

相關(guān)記錄15.1

SOF-PCR011-01-G《PCR實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)記錄表》15.2

S0P-PCR201-01-G《核酸提取編號(hào)記錄表》衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心ClinicalLaboratorien實(shí)驗(yàn)記錄表格的設(shè)計(jì)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories●表格種類繁多●重復(fù)記錄●表格無實(shí)用性，用于檢查的痕跡很重存在問題衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories儀器名稱購買日期儀器編號(hào)維護(hù)要求維護(hù)日期維護(hù)內(nèi)容維護(hù)人員校準(zhǔn)要求校準(zhǔn)日期校

準(zhǔn)

內(nèi)

容操作人簽名日期開機(jī)時(shí)間運(yùn)行狀態(tài)關(guān)機(jī)時(shí)間內(nèi)

容記錄者備

注2345678910111213141516171819202122232425262728293031衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories儀器使用記錄表儀器名稱：

年

月儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)記錄表4本

記

錄

保

存

期

5

年本

記

錄

保

存

期

5

年編號(hào)測定日

期類別(省或衛(wèi)生部)專業(yè)組上報(bào)截

止日期上傳日

期質(zhì)控測定

人簽名質(zhì)控上傳

人簽名備注1234567891011121314151617181920日

期試劑區(qū)標(biāo)本處理區(qū)擴(kuò)增檢測區(qū)執(zhí)行人12345678910111213141516171819202122232425262728293031衛(wèi)工

可pu

四

TT

心NationalCenterForClinical

Laboratories室間質(zhì)評(píng)記錄表年年

月注：消毒時(shí)間必須30-60分鐘，消毒結(jié)束后必須打

√簽字。紫外消毒車消毒記錄表注：質(zhì)評(píng)結(jié)果按衛(wèi)生部或省臨檢中心的要求需另附本記

錄

保

存

期

5

年本

記

錄

保

存

期

5

年日期度

亡度記錄者篇名備莊11410鋪12023編號(hào)日

期拒

收

原

因送檢人

簽

字接收人簽

字備

注1234567891011121314151617181920衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinical

Laboratorien

記

者

期

A

實(shí)驗(yàn)空環(huán)境溫濕度記錄表拒收標(biāo)本記錄表年

月請(qǐng)選擇1.gt試

2.C件.礦檢向n本

記

錄

保

存

期

5

年記錄表格設(shè)計(jì)的基本原則●

信息充分●簡單明了融入LIS系統(tǒng)?衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心NationalCenterForClinicalLaboratories●臨床標(biāo)本的檢測信息能有機(jī)聯(lián)系起來實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備試劑在有效期內(nèi)擴(kuò)增儀、加樣器和溫度計(jì)在校準(zhǔn)的有效期內(nèi)

生物安全柜的濾膜在使用有效期內(nèi)

消毒溶液在有效期內(nèi)洗眼器內(nèi)無菌生理鹽水在有效期內(nèi)

離心管、帶濾芯吸頭已經(jīng)過質(zhì)檢合格操作者：臨床PCR檢驗(yàn)流程記錄表檢驗(yàn)日期