生物化學(xué)與分子生物學(xué)八課件26市公開(kāi)課一等獎(jiǎng)百校聯(lián)賽特等獎(jiǎng)?wù)n件

第二十五章

基因結(jié)構(gòu)分析基本策略Basicstrategyforanalyzinggenestructure

第1頁(yè)主要內(nèi)容：第一節(jié)基因序列結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)檢索和比對(duì)分析第二節(jié)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)判定第三節(jié)開(kāi)啟子結(jié)構(gòu)及功效分析第四節(jié)編碼序列結(jié)構(gòu)分析第2頁(yè)第一節(jié)基因序列結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)檢索和比對(duì)分析第3頁(yè)就是在數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)基因序列或DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，以其能夠推測(cè)出其結(jié)構(gòu)、功效及在進(jìn)化上聯(lián)絡(luò).比對(duì)方法：

1.雙重比對(duì)

2.多序列比對(duì)序列比對(duì)目標(biāo)：判斷兩個(gè)或多個(gè)序列間是否含有足夠相同性從而判斷二者之間是否含有同源性直接數(shù)量關(guān)系進(jìn)化上曾含有共同祖先基因或DNA序列比對(duì)第4頁(yè)序列比對(duì)結(jié)果：取代插入缺失Mouse:GGKDSCQGDSGGPVVCNG----QLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAANCrayfish:GGKDSCQGDSGGPLAASDTGSTYLAGIVSWGYGCARPGYPGVYTEVSYHVDWIKANAV--缺失？保守序列保守序列：可能是共同進(jìn)化標(biāo)志可能并不代表功效主要性插入？當(dāng)兩個(gè)序列非常相同時(shí)，是否一定說(shuō)明它們含有相同功效？第5頁(yè)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI首先創(chuàng)建GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)于1991年開(kāi)發(fā)了Entrez數(shù)據(jù)庫(kù)檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了GenBank、EMBL、PIR和SWISS-PROT等數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息以及MEDLINE相關(guān)序列文件信息，并經(jīng)過(guò)相關(guān)鏈接，將他們有機(jī)地結(jié)合在一起NCBI還提供了其它數(shù)據(jù)庫(kù)，包含在線人類孟德?tīng)栠z傳(OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)分子模型數(shù)據(jù)庫(kù)（MMDB）、人類基因序列集成（UniGene）、人類基因組基因圖譜（GMHG）、生物門類（Toxonomy）等數(shù)據(jù)庫(kù)第6頁(yè)第7頁(yè)1.各種數(shù)據(jù)庫(kù)介紹(1)Nucleotide該數(shù)據(jù)庫(kù)由國(guó)際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)組員美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院GenBank、日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)和英國(guó)HinxtonHall歐洲分子生物學(xué)試驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL）三部分?jǐn)?shù)據(jù)組成三個(gè)組織天天交換各自數(shù)據(jù)庫(kù)中新增序列實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享第8頁(yè)(2)Genome即基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，提供了各種基因組、完全染色體、重合序列圖譜以及一體化基因物理圖譜(3)Structures即結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)或稱分子模型數(shù)據(jù)庫(kù)(MMDB)，包含來(lái)自X線晶體學(xué)和三維結(jié)構(gòu)試驗(yàn)數(shù)據(jù)NCBI已經(jīng)將結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)交叉鏈接到書(shū)目信息、序列數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBITaxonomy中利用NCBI3D結(jié)構(gòu)瀏覽器和Cn3D，能夠很輕易地從Entrez取得分子分子結(jié)構(gòu)間相互作用圖像第9頁(yè)(4)Taxonomy即生物學(xué)門類數(shù)據(jù)庫(kù)，能夠按生物學(xué)門類進(jìn)行檢索或?yàn)g覽其核苷酸序列、蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)等(5)PopSet包含研究一個(gè)人群、一個(gè)種系發(fā)生或描述人群改變一組組聯(lián)合序列PopSet既包含了核酸序列數(shù)據(jù)又包含了蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)第10頁(yè)(7)文件數(shù)據(jù)庫(kù)PubMed：生物醫(yī)藥科學(xué)檢索系統(tǒng)OMIM：孟德?tīng)栠z傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)是人類基因和基因疾病目錄數(shù)據(jù)庫(kù)其它：書(shū)目，雜志，文章引用匹配等該數(shù)據(jù)庫(kù)包含原文信息、圖片和參考信息，同時(shí)還能夠鏈接到Entrez系統(tǒng)MEDLINE數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)文件和序列信息

第11頁(yè)2.NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

在檢索框中輸入檢索詞，檢索詞間默認(rèn)邏輯關(guān)系為AND，檢索規(guī)則基本同PubMed

能夠經(jīng)過(guò)下拉菜單項(xiàng)選擇擇統(tǒng)計(jì)顯示格式，通常選擇GenBank

Report格式或FASTAReport格式。當(dāng)選擇GenBankReport格式后，屏幕顯示較完整基因統(tǒng)計(jì)，包含：基因位點(diǎn)(Locus）、基因定義(Definition）、基因存取號(hào)(Accession）、核酸編號(hào)(NID

）、關(guān)鍵詞(Keywords）、起源(Source）、組織分類(Organism)、參考文件(Reference)、著者(Author）、題目(Title）、期刊(Journal）、Medline存取號(hào)(Medline）、序列特征(Features）、基因(Gene）、CDS（cDNA）、等位基因(Allele）對(duì)等肽(Mat-Peptide

）、計(jì)算堿基數(shù)(BaseCount）、原序列(Origin）。而FASTAReport格式僅包含檢出序列簡(jiǎn)明特征描述。第12頁(yè)比如：人EPO基因序列檢索輸入關(guān)鍵詞，選擇適當(dāng)程序第13頁(yè)向下拉尋找符合目標(biāo)條目第14頁(yè)點(diǎn)擊此條打開(kāi)連接第15頁(yè)向下拉尋找關(guān)注內(nèi)容第16頁(yè)凡是連接地方都能夠點(diǎn)擊查看能夠直接拷貝保留相關(guān)內(nèi)容第17頁(yè)Entrez：是一個(gè)用以整合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中信息搜尋和檢索工具3.NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索工具

BLAST：是一個(gè)NCBI開(kāi)發(fā)序列相同搜索程序，還可作為判別基因和遺傳特點(diǎn)伎倆

NCBI提供附加軟件工含有：開(kāi)放閱讀框?qū)ひ捚鳎∣RFFinder），電子PCR，和序列提交工具，Sequin和BankItEntrez一個(gè)強(qiáng)大和獨(dú)特特點(diǎn)是檢索相關(guān)序列，結(jié)構(gòu)，和參考文件能力

第18頁(yè)Entrez:

第19頁(yè)BLAST:第20頁(yè)BLAST程序程序數(shù)據(jù)庫(kù)查詢內(nèi)容Blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)使用取代矩陣尋找較遠(yuǎn)關(guān)系：能夠進(jìn)行SEG過(guò)濾Blastn核苷酸核苷酸尋找較高分值匹配，對(duì)較遠(yuǎn)關(guān)系不太適用Blastx核苷酸蛋白質(zhì)對(duì)于新DNA序列和ESTs分析極（翻譯）為有用Tblastn蛋白質(zhì)核苷酸對(duì)于尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有標(biāo)注編碼（翻譯）區(qū)極為有用Tblastx核苷酸核苷酸對(duì)于分析EST極為有用（翻譯）（翻譯）第21頁(yè)點(diǎn)擊核酸序列blast，在框內(nèi)輸入序列：第22頁(yè)選擇搜索條件：第23頁(yè)選擇特殊程序：第24頁(yè)比較兩個(gè)序列之間相同性：第25頁(yè)以上僅介紹了NCBI相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及工具軟件關(guān)于其它數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件工具等信息見(jiàn)書(shū)中第二十五章表1-5。第26頁(yè)第二節(jié)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)判定第27頁(yè)主要內(nèi)容：一、基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列特征二、基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列分析第28頁(yè)一、基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列特征

TATAbox

CAATbox

GCbox

增強(qiáng)子

順式作用元件

結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)1.真核基因及其調(diào)控元件第29頁(yè)II型開(kāi)啟子TSS：沒(méi)有明確保守序列有一個(gè)趨勢(shì)，即mRNA第一個(gè)堿基是A，其側(cè)翼堿基傾向于是嘧啶與mRNA第一個(gè)堿基對(duì)應(yīng)位置標(biāo)識(shí)為-1區(qū)-3~+5區(qū)域被稱作起始子(initiator)2.轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（TSS）+10+20Startsite-10-20-30-40+1ATG-3+5InitiatorPy2CAPy5第30頁(yè)二、基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列分析思索：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)位于基因編碼序列5

端基因編碼區(qū)是指能表達(dá)在多肽鏈中核苷酸序列多肽鏈?zhǔn)且詍RNA為模板經(jīng)翻譯合成所以，分析判定TSS方法都是以cDNA為切入點(diǎn)第31頁(yè)1.cDNA克隆測(cè)序AAAAAnAAAAAnAAAAAnmRNA反轉(zhuǎn)錄酶AAAAAnOligo(dT)15-18TTTTT15-18cDNA第一鏈CCCCCTTTTT15-18cDNA第一鏈nCCCCnGGGGcDNA第二鏈克隆擴(kuò)增，5

端測(cè)序分析反轉(zhuǎn)錄酶末端轉(zhuǎn)移酶活性O(shè)ligo(dG)15-18mRNA與線性載體相連接要求：cDNA5

端完整無(wú)缺第32頁(yè)2.cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)傳統(tǒng)RACE：AAAAAnmRNAAAAAAnTTTTT15-18cDNAmRNA-5

3-反轉(zhuǎn)錄酶Oligo(dT)15-18末端轉(zhuǎn)移酶dGTPTTTTT15-18nGGGGG錨定PCR擴(kuò)增TTTTT15-18nGGGGGnCCCCC錨定引物特異引物PCR產(chǎn)物第33頁(yè)Deep-RACE：用寡核苷酸替換mRNA5′端帽結(jié)構(gòu)以及發(fā)光標(biāo)識(shí)巢氏PCR引物實(shí)現(xiàn)高通量判定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)

AAAAAn5-p帽mRNA牛小腸磷酸酶(CIP)AAAAAn5-帽煙草酸焦磷酸酶(TAP)AAAAAn5-將5-RACEadaptor(寡核苷酸)加到脫帽RNA分子上AAAAAn5-RACEadaptor(寡核苷酸)反轉(zhuǎn)錄酶10nt隨機(jī)引物第34頁(yè)5-RACEadaptor5-RACEadaptor5-RACEadaptor5-RACEadaptor長(zhǎng)短不一樣cDNA隨機(jī)引物用10nt隨機(jī)引物與5-RACE引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增5-RACEadaptor5-RACEadaptor5-RACEadaptor5-RACEadaptorPCR產(chǎn)物隨機(jī)引物以5’-RACE引物和5’端甩尾基因特異性反向引物進(jìn)行巢氏PCR5-RACEadaptor以5’-RACE發(fā)光標(biāo)識(shí)引物對(duì)PCR混合物直接進(jìn)行一次性測(cè)序分析基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)第35頁(yè)3.連續(xù)分析基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)

在RACE基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)在轉(zhuǎn)錄本5′端引入一個(gè)特殊II型限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了基因5′端短片段串聯(lián)連接產(chǎn)物一次測(cè)序分析多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)目標(biāo)主要有兩種方法：5′端連續(xù)分析基因表示（5′-endserialanalysisofgeneexpression,5′SAGE）帽分析基因表示（capanalysisgeneexpression,CAGE）第36頁(yè)(1)5′SAGE5′SAGE是在PCR過(guò)程中將MmeI酶切位點(diǎn)引物cDNA5′端，經(jīng)過(guò)酶切和連接取得不一樣短片段重復(fù)序列，并對(duì)重復(fù)序列進(jìn)行測(cè)序取得大量片段序列信息不一樣序列短片段代表不一樣基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)

MmeI:是一個(gè)特殊II型限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列不是回文結(jié)構(gòu)，而是不對(duì)稱DNA序列5′-TCCRAC-3′（R代表G或A）在識(shí)別位點(diǎn)下游18~20堿基處切開(kāi)雙鏈DNA

第37頁(yè)GpppAAAAAAAAnmRNA用BAP和TAP處理AAAAAAAAnp在RNA5

端加上寡核苷酸帽AAAAAAAAn5

XhoIMmeI反轉(zhuǎn)錄酶RT5

AAAAAAAAn5

cDNAPCRBiotin-標(biāo)識(shí)引物隨機(jī)引物5

5

BiotinMmeI酶切消化5

20mer5

Biotin親和素用親和素-生物素，能夠?qū)?-端片段與其它片段分離開(kāi)第38頁(yè)5

20mer連接5

Biotin5

Biotin5

20merPCR擴(kuò)增5

5

Biotin5

Biotin5

XhoI酶切消化本身連接串聯(lián)體測(cè)序分析第39頁(yè)(2)CAGECAGE與5′SAGE非常相同所不一樣是:CAGE不需要在RNA上加接頭，而是用oligo(dT)引物先進(jìn)行第一鏈cDNA合成然后經(jīng)過(guò)捕捉帽結(jié)構(gòu)，將含有MmeI和另一內(nèi)切酶位點(diǎn)如XmaJIlinker加到單鏈全長(zhǎng)cDNA3′末端第40頁(yè)AAAAAAnCapmRNA反轉(zhuǎn)錄酶Oligo(dT)15~18AAAAAAnCapTTTTTTTncDNA捕捉5-帽結(jié)構(gòu)單鏈linker連接TTTTTTTnBiotincDNA第二鏈合成TTTTTTTnAAAAAAnMmeIXmaJIMmeI酶切親和素20mer用親和素-生物素，能夠?qū)?-端片段與其它片段分離開(kāi)第41頁(yè)連接第二個(gè)linkerXbaIXmaJIXmaJI,Xbal酶切消化PCR（用linker1和linker2作引物）Linker1Linker2純化，串聯(lián)連接，克隆20merXmaJI和XbaI是同尾酶：XmaJI：C^CTAGGXbaI：T^CTAGA串聯(lián)體測(cè)序分析第42頁(yè)第三節(jié)開(kāi)啟子結(jié)構(gòu)及功效分析第43頁(yè)主要內(nèi)容：一、開(kāi)啟子結(jié)構(gòu)分析二、開(kāi)啟子功效分析第44頁(yè)開(kāi)啟子（promoter）是一段能被蛋白質(zhì)識(shí)別、參加特定基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA序列II型開(kāi)啟子通常位于結(jié)構(gòu)基因上游共通序列(consensussequence)是其特征性序列共通序列和開(kāi)啟子所處位置是研究開(kāi)啟子主要線索第45頁(yè)+10+20Startsite-10-20-30-40+1ATG-3+5Initiator

共通序列比如：原核基因共通序列：-10區(qū)：Pribnowbox（T77A76T60A61A56T82序列）-35區(qū)：T69T79G61A56C54A54序列真核基因共通序列：真核基因開(kāi)啟子在-50區(qū)域附近（大約5%~30%基因開(kāi)啟子在-25~-30區(qū)域）有TATAbox（TATAAA序列）TATAATTTGACA第46頁(yè)一、開(kāi)啟子結(jié)構(gòu)分析主要方法：利用PCR技術(shù)克隆開(kāi)啟子利用核酸-蛋白質(zhì)相互作用方法研究開(kāi)啟子生物信息學(xué)預(yù)測(cè)開(kāi)啟子第47頁(yè)（一）利用PCR技術(shù)克隆開(kāi)啟子特異性基因序列基因上游序列基因組DNA依據(jù)基因序列合成一條反向引物正向引物用隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增隨機(jī)引物特異引物克隆及測(cè)序分析注意：真核基因有內(nèi)含子，應(yīng)該依據(jù)mRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物特異性引物盡可能靠近基因5

端1.依據(jù)已知基因序列直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增第48頁(yè)2.利用TSS釣取開(kāi)啟子AAAAAAnCap5-mRNA反轉(zhuǎn)錄AAAAAAnTTTTTTncDNA插入載體，克隆擴(kuò)增Cap5-以基因特異引物與載體引物配對(duì)PCR擴(kuò)增5-測(cè)序分析基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列以TSS序列為引物，基因組序列為模板，與隨機(jī)引物配對(duì)進(jìn)行TSS上游序列PCR擴(kuò)增第49頁(yè)3.利用環(huán)狀PCR釣取開(kāi)啟子基因組DNA酶切消化基因組DNA片段直接環(huán)化連接加上接頭后環(huán)化連接依據(jù)基因上游序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向互補(bǔ)引物PCR擴(kuò)增依據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增克隆測(cè)序分析克隆測(cè)序分析加接頭環(huán)化PCR不依賴特異基因序列可用于篩選開(kāi)啟子接頭第50頁(yè)（二）利用核酸-蛋白質(zhì)互作方法研究開(kāi)啟子開(kāi)啟子是一段能被蛋白質(zhì)識(shí)別和結(jié)合DNA序列，所以，能夠檢測(cè)核酸-蛋白質(zhì)相互作用研究方法都能夠用于開(kāi)啟子研究中

主要方法：足跡法（酶足跡法，化學(xué)足跡法）電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（EMSA）染色體免疫沉淀（ChIP）第51頁(yè)1.用足跡法研究開(kāi)啟子足跡法（Footprinting）利用DNA電泳條帶連續(xù)性中止圖譜特點(diǎn)判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合DNA區(qū)域基本流程：DNA與蛋白質(zhì)相互作用切割DNA凝膠電泳分析電泳圖譜蛋白與未標(biāo)識(shí)競(jìng)爭(zhēng)DNA結(jié)合蛋白與標(biāo)識(shí)DNA結(jié)合凝膠電泳放射自顯影第52頁(yè)（1）酶足跡法(Enzymaticfootprinting)

利用能切割DNA酶處理DNA-蛋白質(zhì)混合物，然后經(jīng)過(guò)電泳進(jìn)行分析

DNaseI足跡法

(DNaseIfootprinting)是一個(gè)利用DNaseI

隨機(jī)切割雙鏈DNA，從而確定DNA結(jié)合蛋白在DNA上結(jié)合位點(diǎn)方法

核酸外切酶III足跡法

(ExonucleoaseIII

footprinting)是利用核酸外切酶III（ExoIII）3

5

外切酶活性從3

末端切割雙鏈DNA特征，確定蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點(diǎn)慣用方法第53頁(yè)DNaseI

足跡法dsDNA單鏈末端標(biāo)識(shí)DNA結(jié)合蛋白DNaseI酶切消化（控制反應(yīng)時(shí)間）產(chǎn)生長(zhǎng)短不一樣片段但蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)被保護(hù)第54頁(yè)蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)MNo-proPro-DNA對(duì)在凝膠上出現(xiàn)空白區(qū)域DNA進(jìn)行克隆測(cè)序，即可確定結(jié)合蛋白質(zhì)DNA序列變性凝膠電泳第55頁(yè)（2）化學(xué)足跡法(Chemicalfootprinting)是利用能切斷DNA骨架化學(xué)試劑處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而經(jīng)過(guò)化學(xué)試劑無(wú)法靠近結(jié)合蛋白質(zhì)DNA區(qū)域而確定DNA蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)主要方法：羥自由基足跡法體內(nèi)足跡法第56頁(yè)1）羥自由基足跡法（Hydroxylradicalfootprinting）化學(xué)試劑羥自由基利用化學(xué)試劑產(chǎn)生羥自由基攻擊DNA分子表面脫氧核糖骨架使DNA斷裂當(dāng)DNA結(jié)合蛋白將脫氧核糖遮蓋時(shí)，自由羥基無(wú)法攻擊而使這個(gè)區(qū)域DNA受到保護(hù)電泳圖譜上出現(xiàn)空白區(qū)地方就是結(jié)合蛋白質(zhì)DNA變性凝膠電泳第57頁(yè)2）體內(nèi)基足跡法（Invivofootprinting）

用化學(xué)試劑對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)處理，使DNA在細(xì)胞內(nèi)受到化學(xué)修飾，然后裂解細(xì)胞，用化學(xué)法或酶法進(jìn)行足跡試驗(yàn)。甲基化干擾試驗(yàn)

(Methylationinterferenceassay)是利用化學(xué)試劑如硫酸二甲酯（Dimethylsulfate,DMS）對(duì)活細(xì)胞DNA進(jìn)行甲基化修飾，從而干擾蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合。乙基化干擾試驗(yàn)

(Ethylationinterferenceassay)是利用化學(xué)試劑對(duì)活細(xì)胞DNA進(jìn)行乙基化修飾，從而干擾蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合。第58頁(yè)化學(xué)試劑提取DNADNaseI或化學(xué)試劑變性凝膠電泳分析切割DNA化學(xué)修飾對(duì)蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合有干擾，所以，體內(nèi)足跡試驗(yàn)也叫干擾試驗(yàn)電泳圖譜需與未修飾DNA樣品進(jìn)行比較，在未修飾樣品中出現(xiàn)空白區(qū)位置是體內(nèi)發(fā)生化學(xué)修飾DNA區(qū)域正常對(duì)照化學(xué)修飾提取DNA第59頁(yè)2.用電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)研究開(kāi)啟子電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)

(Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)是利用結(jié)合蛋白質(zhì)DNA片段在凝膠中遷移滯后特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)電泳分離研究核酸-蛋白質(zhì)互作方法又稱為凝膠阻滯試驗(yàn)(Gelretardationassay)第60頁(yè)細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物標(biāo)識(shí)DNA片段蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物電泳遷移滯后凝膠電泳顯影滯后條帶表明DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域第61頁(yè)3.用染色體免疫沉淀技術(shù)研究開(kāi)啟子染色體免疫沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)是在保持蛋白質(zhì)與染色體DNA結(jié)合同時(shí)，將染色體切割成小片段并沉淀下來(lái)

非變性ChIP：是先用核酸酶處理細(xì)胞核，將染色體消化成碎片，然后用適當(dāng)抗體將結(jié)合有蛋白質(zhì)染色體片段經(jīng)過(guò)免疫沉淀選擇出來(lái)，再以PCR或核酸雜交技術(shù)對(duì)DNA序列進(jìn)行分析變性ChIP：是先用甲醛處理細(xì)胞，使蛋白質(zhì)與DNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生交聯(lián)，然后分離染色體并進(jìn)行剪切，用特異性抗體與DNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，以沉淀法分離DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體前面章節(jié)已介紹，這里不再詳述第62頁(yè)（三）生物信息學(xué)預(yù)測(cè)開(kāi)啟子真核基因組測(cè)序正在以不停增加速度進(jìn)行著，當(dāng)前已經(jīng)能夠取得大約50個(gè)完整真核生物基因組序列信息，預(yù)計(jì)在未來(lái)幾年內(nèi)將會(huì)完成更多基因組測(cè)序工作對(duì)基因組注釋工作中最難就是準(zhǔn)確判定和描繪開(kāi)啟子，所以，開(kāi)啟子預(yù)測(cè)就顯得非常主要預(yù)測(cè)開(kāi)啟子切入點(diǎn)開(kāi)啟子結(jié)構(gòu)特征開(kāi)啟子在染色體上位置第63頁(yè)1.開(kāi)啟子結(jié)構(gòu)特征經(jīng)典開(kāi)啟子關(guān)鍵開(kāi)啟子：普通在TSS上游-35區(qū)域以內(nèi)近端開(kāi)啟子：普通包括TSS上游幾百個(gè)堿基遠(yuǎn)端開(kāi)啟子：普通包括TSS上游幾千個(gè)堿基含有增強(qiáng)子或緘默子一些特征性結(jié)構(gòu)TSS附近CG島經(jīng)常出現(xiàn)在開(kāi)啟子中共通序列(consensussequence)第64頁(yè)2.開(kāi)啟子預(yù)測(cè)分析EPD(Eukaryoticpromoterdatabases)TRRD(Transcriptionregulatoryregionsdatabases)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)

(DBTSS)

開(kāi)啟子數(shù)據(jù)庫(kù)這些數(shù)據(jù)庫(kù)主要經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)識(shí)別、判斷及分析，在數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找開(kāi)啟子特異性特征結(jié)構(gòu)。第65頁(yè)二、開(kāi)啟子功效分析開(kāi)啟子通常是基因上游參加基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA序列。因?yàn)殚_(kāi)啟子中順式作用元件在基因特異性表示中發(fā)揮主要作用，所以，能夠經(jīng)過(guò)連接匯報(bào)基因研究開(kāi)啟子功效。1.匯報(bào)基因(Reportergene)是研究者們?yōu)榱酥圃煲粋€(gè)可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下或動(dòng)植物體內(nèi)作為篩選標(biāo)志易檢測(cè)信號(hào)，經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)操作將發(fā)光蛋白或酶編碼基因附加到一個(gè)感興趣基因上或插入基因調(diào)控序列下游，從而監(jiān)測(cè)感興趣基因表示或分析基因調(diào)控序列活性

。第66頁(yè)慣用匯報(bào)基因熒光蛋白編碼基因：綠色熒光蛋白(GFP)紅色熒光蛋白(dsRed)蛋白酶：熒光素酶(luciferase)-半乳糖苷酶在藍(lán)色光源照射下發(fā)綠光能催化熒光素(luciferin)發(fā)生氧化反應(yīng)發(fā)光能使細(xì)菌在X-gal存在條件下變成藍(lán)色第67頁(yè)2.匯報(bào)基因應(yīng)用監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)染效率匯報(bào)基因與目標(biāo)基因分別插入各自開(kāi)啟子下游，實(shí)現(xiàn)匯報(bào)基因組成性表示模式監(jiān)控目標(biāo)基因表示匯報(bào)基因與目標(biāo)基因融合共同受控于一個(gè)開(kāi)啟子，匯報(bào)基因表示即代表目標(biāo)基因表示研究開(kāi)啟子活性匯報(bào)基因插入被研究開(kāi)啟子下游，經(jīng)過(guò)觀察匯報(bào)基因表示情況推測(cè)開(kāi)啟子活性第68頁(yè)開(kāi)啟子捕捉技術(shù)(promotertrapping)：是一個(gè)研究開(kāi)啟子活性篩選方法基本流程：構(gòu)建開(kāi)啟子捕捉載體觀察匯報(bào)基因表示匯報(bào)基因MCSori候選開(kāi)啟子序列插入MCS轉(zhuǎn)染細(xì)胞觀察匯報(bào)基因表示開(kāi)啟子捕捉載體第69頁(yè)第四節(jié)編碼序列結(jié)構(gòu)分析

第70頁(yè)編碼序列(codingsequence)：

通常是指能表達(dá)在蛋白質(zhì)氨基酸序列中基因信息主要內(nèi)容一、基因編碼序列結(jié)構(gòu)特征二、基因編碼序列結(jié)構(gòu)分析第71頁(yè)一、基因編碼序列結(jié)構(gòu)特征基因編碼序列含有一些特征性序列比如：開(kāi)放閱讀框架蛋白質(zhì)翻譯起始密碼子和終止密碼子真核基因外顯子（編碼序列）和內(nèi)含子（非編碼序列）之間有特殊序列第72頁(yè)（一）開(kāi)放閱讀框架開(kāi)放閱讀框架(openreadingframe,ORF)是指生物基因組中含有能潛在編碼蛋白質(zhì)一段核苷酸序列在基因