應用指南 - 小規(guī)模純化AAV-MAX系統生產的AAV

介紹Gibco?AAV-MAXHelper-Free無輔助病毒AAV生產系統是一生產。AAV-MAX系統包括一個克隆性HEK293F來源的懸浮細（booster）、轉染增強劑（enhancer）和裂解緩沖液。策略1是一項較基礎的工藝，不必使用昂貴的設備和過濾器，而是通過離心法直接澄清，并通過切向流過濾法（TFF）進行濃縮，這對于早期發(fā)現或實驗室小規(guī)模的考察研究來說是POROS?AAVX親和樹脂分別實現了AAV血清型6（rAAV6）載體70%和49%的重組AAV總工藝回收率，證明了在典型的材料和方法根據AAV-MAX用戶指南（出版號：MAN0019619），針對策略1和策略2分別在兩個2.8L搖瓶和四個2.8L搖瓶中使用完整的AAV-MAX系統試劑盒（表1）生產rAAV裂解和核酸酶處理在收獲時（轉染后3天），將10倍Gibco?AAV-MAX裂解緩程中，加入最終濃度為2mM的MgCl2和最終濃的ThermoScientific?Pierce?通用核酸酶，以消化rAAV顆粒中未被衣殼化的DNA。將培養(yǎng)物放在37℃的培養(yǎng)箱中，在轉速125rpm的搖床平臺上培養(yǎng)2小時。策略1細胞裂解細胞裂解用AAV-MAX裂解緩沖液裂解2L細胞培養(yǎng)物澄清以6,000xg的速度離心30分鐘；NalgeneRapid-Flow過濾裝置（0.2μm）親和性POROSGoPureAAVX預裝柱，1mLMiniKros柱（10倍濃縮系數）策略2澄清澄清深層過濾器組：Millistak+C0SP過濾器，Millistak+F0HC過濾器，和Sartopore2XLG過濾器MiniKros柱（20倍濃縮系數）；6倍滲濾體積滲濾細胞裂解用AAV-MAX裂解緩沖液裂解4L細胞培養(yǎng)物親和性POROSGoPureAAVX預裝柱，1mL2表1.用于AAV生產和純化的材料。工藝步驟工藝步驟材料描述貨號AAV-MAXHelper-Free無輔助病毒AAV生產系統試劑盒A51217CN（含國產化細胞）AAV-MAX裂解緩沖液（10倍）A505201MMgCl2J61014.AK88702Pierce通用核酸酶88702ThomsonOptimumGrowth2.8L燒瓶（）50-112-006NalgeneRapid-Flow帶PES膜的無菌一次性過濾裝置（0.2μm）567-0020真空泵（Welch）I31-0176SorvallLYNX6000超速離心機75006590NalgenePPCO離心瓶3120-1000MasterflexL/S泵（）07522-20Masterflex鉑金固化硅膠管，25號（）96440-2516100118Millistak+HCPro深層過濾器，C0SP（MilliporeSigma）MC0SP027H1Millistak+Pod深層過濾器，F0HC（MilliporeSigma）MF0HC027H1Sartopore2XLG過濾器（Sartorius）5441307G4-SS-BMasterflexL/S泵（）07522-20Masterflex鉑金固化硅膠管，25號（）。96440-25PL1905847Q試劑瓶（Corning）431432MiniKros中空纖維TFF組件（Repligen）S02-E100-05-NSciLog壓力傳感器（Parker）080-699PSX-3P-5SciLog壓力監(jiān)測儀（Parker）SP0820J-1329POROSGoPureAAVX預裝柱A36652策略1：離心澄清和TFF將用核酸酶處理過的細胞裂解液在20℃下以6,000xg的速度離心30分鐘。將上清液倒入ThermoScientific?Nalgene?Rapid-Flow?無菌一次性過濾裝置（0.2μm），并使用真空裝置開始進行過濾。在2-8℃下儲存一心澄清和過濾方案重新澄清已經過澄清的裂解液，然后裝入以沖掉過濾器中的儲存甘油，然后用過濾面積為1mL/cm2的以2,000s-1（368mL/min）的剪切率在HFTFF中再循環(huán)已經過澄清的裂解液。使用軟管旋塞向再循環(huán)管路施加背壓并進行倍后，將其收集起來。用1.4倍滯留體積的親和平衡緩沖液來淋洗HFTFF，并將其與HFTFF產物混合。按照上使用NalgeneRapid-Flow一次性無菌過濾器裝置（0.2μm）對混合的淋洗和HFTFF產物進行離心和過濾。3策略2：深層過濾澄清和TFF2/hrmL/min）的流速沖洗Millistak+?C0SP和F0HC深層過濾器，或者直至從過濾器中排出所有空氣。將Millistak+C0SP過濾器的出口與F0HC過濾器的入口相連接；將F0HC過濾器的出口與Sartopore?2XLG過濾器的入口相連接。用1.5倍深層過濾器滯留體積（975mL）的澄清緩沖液以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速平衡整個過濾器組。以150L/m2/hr（67.5過濾器重新澄清已經過澄清的裂解液，然后將其加載到MiniKrosHFTFF柱上（表2）。用過濾面積為2mL/cm2的DI水新的中空纖維過濾器，以沖掉過濾器中的儲存甘油，然后用過濾面積為1mL/cm2的親和平衡緩沖液進行平衡。以2,000s-1（368mL/min）的剪切率在HFTFF中再循環(huán)已經過澄清的裂解液。使用軟管旋塞向再循環(huán)管路施加背壓并進行調整，使整液交換。緩沖液交換通過在保持20倍濃縮體積的情況下向樣本槽中緩慢加入6個滲濾體積的親和力平衡緩沖液2來進緩沖液交換完成后，收集材料。用1.4倍滯留體積的親和平衡緩沖液來淋洗HFTFF，并將其與HFTFF產物混合。使用Sartopore2XLG過濾器過濾混合的淋洗和HFTFF產品。參數設置2,000s-1<5psi10倍或20倍6個滲濾體積25親和純化純化前，用0.5NNaOH對?KTA?FPLC系統進行滅菌處理，CV的0.2M磷酸（接觸時間為15分鐘）、5個CV的6M鹽酸胍、5個CV的2MHCL、5個CV的洗滌1緩沖液、10個CV的略2）以300cm/hr的流速對ThermoScientific?POROS?接下來，以300cm/hr的流速將過濾后的HFTFF產物加載到色譜柱上（相應的停留時間為1分鐘）。待過濾后的HFTFF產物加載完成后，先后用10個CV的平衡緩沖液、三個不同的中間沖洗液（每種均為5個CV）、10個CV的平衡緩沖液洗滌色譜柱。用pH值為2.5的甘氨酸緩沖液洗脫rAAV6。先后用7個CV的0.2M磷酸（接觸時間為15分鐘）、5個CV的6M鹽酸胍、5個CV的親和平衡緩沖液、5個CV的2MHCL、10個CV的DI水對POROSGoPureAAVX柱進行剝離和滅菌處理，然后將其保存在5個CV的20%乙醇中。通過ddPCR對病毒基因組進行定量使用靶向GFP基因的引物和探針通過微滴式數字PCR（ddPCR）測定每毫升病毒基因組的AAV滴度（vg/mL）。在進行ddPCR然后，在QX200?微滴式數字PCR系統（Bio-Rad）上運行每測定完整衣殼的百分比根據制造商的說明使用AAV6ELISA試劑盒（Progen）殼滴度。用基因組滴度除以衣殼滴度，以測定洗脫組分中完整通過流式細胞儀對轉導單位進行定量然后用連續(xù)稀釋的rAAV6-GFP過程樣本和5型腺病毒輔助病毒共同感染細胞。根據用流式細胞儀測定的每個孔的GFP陽性細胞數量來計算每個樣本的轉導單位（TU/mL）。濁度測量濁度測量全部在ThermoScientific?Orion?AQUAfastAQ30104表3.親和純化方法。緩沖液或溶液緩沖液或溶液0.980.980.2M磷酸50mMTris，1.5MNaCl，0.01%Pluronic?F-68表面活性劑，pH7.2PluronicF-68表面活性劑，pH7.2PluronicF-68表面活性劑，pH7.2B6B3B2B1A230030030030055555-0.98150.980.98150.98-0.98-0.98300-0.98-0.98300-0.98A13005-0.98A13005-0.98沖洗液30.98沖洗液3輸出3輸出53005A1-3005A10.98300.141分鐘的停S1PluronicF-68表面活性劑，pH0.98300.141分鐘的停S10.98PluronicF-68表面活性劑，pH7.20.9810300A1-10300A10.98PluronicF-68表面活性劑，pH7.20.98A23005-50mMTris，1.5MNaCl，0.01%PluronicF-68表面活性劑，pH7.2A23005-3000.983000.98A35-50mMTris，1.5M尿素，0.01%Pluronic3000.983000.98A35-A45-50mMTris，1%Tween?20表面活性劑，0.01%PluronicF-68表面活性劑，pH9.0A45-3000.98PluronicF-683000.9810A1-10A1PluronicF-68表面活性劑，pH7.21分鐘的停0.98300.14A5B3B3B255250.98300300300-75mM甘氨酸，50mMNaCl，500mM精氨酸，0.01%PluronicF1分鐘的停0.98300.14A5B3B3B255250.98300300300-0.98150.2M磷酸0.98150.98-0.98-0.98PluronicF-68表面活性劑，pH7.20.983005A1-3005A1PluronicF-68表面活性劑，pH7.20.980.98B1B6A6A73003000.980.98B1B6A6A73003003003005555-0.98-0.98--20%乙醇0.98-0.98--5結果就親和層析前AAV6培養(yǎng)物的處理對兩種不同策略進行了測試。策略1使用離心和過濾來產生澄清的裂解液，然后在生澄清的裂解液，然后在HFTFF上進行20倍濃縮和濾體積的緩沖液交換。每項策略的測試結果策略1：離心澄清經過裂解和核酸酶處理的AAV6培養(yǎng)物的濁度為302個散射濁度單位（NTU細胞培養(yǎng)物的滴度為7.85x1013vg/L（圖2和3）。在0.2μmNalgeneRapid-Flow過濾裝置上經過離心和過濾后，濁度降至16.49NTU，該過程的每步產率為94%，細胞培養(yǎng)的滴度為7.36x1013vg/L（圖2和3）。在HFTFF上進行了53分鐘的10倍濃縮，平均滲透通量為28L/m2/h在該步驟中未觀察到滴度損失。將HFTFF產物在0NalgeneRapid-Flow過濾裝置上進行離心和過濾后，濁度降載過程中，最大柱前壓和△柱壓均保持在0.0和純化產物產生了5.49x1013vg/L的細胞培養(yǎng)物，每步產率為74%，整體過程產率為70%（圖3）。Millistak+F0HC過濾器上的最大壓力達到1.34psi。Sartopore2XLG過濾器上的最大壓力達到0.8psi（圖9）。澄清步驟將濁度降至1.03NTU，每步的產率為70%，細胞培養(yǎng)物的滴度為8.29x1013vg/L（圖2和3）。在HFTFF上進行了52.6HFTFF上進行了總共22.9分鐘的6個滲濾體積的緩沖液交換，平均滲透通量為21.4LMH。失降至最低，每步的產率為76%（圖2和3）。HFTFF產物在Sartopore2XLG過濾器上進行過濾后，濁度降至7.47NTU。TFF產物策略2過濾后的TFF產物策略2過濾后的TFF產物感染性在整個純化過程中保持不變；提取的細胞培養(yǎng)物和親和產物的感染性值均為3.32x103vg/TU（圖6）。該純化不包括富集完整衣殼，所以完整衣殼的百分比在純化過程的各個步驟中保持相對穩(wěn)定，其范圍約為20-30%（圖7）。使用SDS，顯示親和產物的大小策略2：深層過濾器澄清經過裂解和核酸酶處理的AAV6培養(yǎng)物的濁度為442NTU，細胞培養(yǎng)物的滴度為1.18x1014vg/L（圖2和3）。通過Millistak+C0SP、Millistak+F0HC和Sartopore2XLG過濾器組進行了74分澄清產物TFF產物過濾后的策略1的滴度策略2的滴度策略1的滴度策略2的滴度--策略2的每步產率圖3.每個工藝步驟中細胞培養(yǎng)物的滴度和每步產率。通過ddPCR測定滴度（vg/mL然后用vg/mL以測定細胞培養(yǎng)物的滴度（vg/L）。通過該值，可以比較每個工藝步驟中兩種純化策略的滴度需考慮每步所處理材料的體積。滴度變化可用于確定每個工6策略1通量（LMH）策略1策略1通量（LMH）策略1TMP（psi）策略2初始滲濾策略2TMP（psi）器連接至過濾器的入口、截留物和透過物上。取入口和截留物壓力的平均值，然后減去透過物壓力，以計算出跨膜壓（T塞來調整截留物的背壓，使TMP達到目標值5psi。在TFF期間，每隔2-5分鐘收集一次透過物并進行稱重。用以kg為單位（與升相關）的透過物除以處理時間，以確定透過物的流速（升/時）。然后用透過這兩種策略的滲透通量都是隨著濃度系數的增加而衰減。在緩沖液交換期間，由于濃度在這一步保持不變，通量比較穩(wěn)定。在整策略1UV吸光度280nm策略1UV吸光度260nm策略2UV吸光度280nm策略2UV吸光度260nm提取的細胞培養(yǎng)物親和產物澄清產物TFF提取的細胞培養(yǎng)物親和產物TFF產物策略2策略策略2圖6.每個工藝步驟的感染性。感染性滴度（TU/mL）和vg/mL分別通過流式細胞儀和ddPCR測定。vg/TU的值通過vg/mL滴度除以感染性滴度計算親和產物提取的細胞培養(yǎng)物澄清產物過濾后的TFF親和產物產物策略1策略1圖7.每個工藝步驟中完整衣殼的百分比。別通過ddPCR和ELISA測capsids/mL計算出完整衣殼的百分比。層析過程中，使用?KTAFPLC系統nm。初始寬峰（A）與流經親和柱但未7無產物損失。在親和加載過程中，UVA280信號僅達到215mAU，這表明一保持在0.07MPa以下。親和純化產物產生了5.78x1013vg/L的細胞培養(yǎng)物，提供了49%的總工藝取的細胞培養(yǎng)物（3.68x103vg/TU）和親和產物（2.79x103vg/TU）保持富集完整衣殼，所以完整衣殼的百分比在純化過程的各個步驟中保持相對用SDS，顯示親和產物的大小結論本文介紹了兩種使用AAV-MAX系統兩種策略都能獲得高質量和高產量的為70%和49%。在策略2中觀察到的策略1泳道描述1請參見BluePlus2標準品2親和加載3親和流穿液4親和沖洗液15親和沖洗液26親和沖洗液37親和產物8親和剝離液9請參見BluePlus2標準策略2泳道描述1請參見BluePlus2標準2請參見BluePlus2標準3親和加載4親和流穿液5親和沖洗液16親和沖洗液27親和沖洗液38親和產物9親和剝離液10請參見BluePlus2標準圖8.親和工藝步驟的樣本SDS-PAPlus2預染蛋白標準品加載到Invitrogen?NuPAGE?4-12%Bis-Tris凝膠上，然后在200V下運行35分鐘。接著使用Invitrogen?SimplyBlue?SafeStain對凝膠進行染色。處理時間（分鐘）C0SP過濾器F0HC過濾器開始淋洗SartoporeC0SP過濾器F0HC過濾器開始淋洗Millistak+C0SP過濾器前面添加壓力傳感器1。在Millistak+C0SP和Millistak+F0HC過濾器之間添加壓力傳感器2。在Millistak+F0HC過濾器和Sartopore2XLG過濾器之間添加壓力傳感器3。在處理過程中，每隔5分鐘記錄一次壓力讀數。使用傳感器1和傳感器2之間的Δ壓力測定Millistak+C0SP過濾器的壓力。使用傳感器2和傳感器3之間的Δ壓力測定Millistak+F0HC的壓力。使用傳感器3的壓力讀數測定Sartopore2XLG過濾器的壓力。壓力超過濾器堵塞。在運行期間，過濾器的壓力均未超過2.5psi。8兩種策略之間的顯著區(qū)別是，策略2產生的中間產物濁度的A280值更低。策略2的澄清產物和TFF產物的分別低94%和90%。策略2在濃高33%，在親和流穿液中的A280值比策略1低89此類差異，但兩種策略的最終親和產物在感染性、完整衣殼的百分比和產量方面是相當的。我們建議用策略1進行初始發(fā)現或小規(guī)模的考察研究。策略2適用于工藝開發(fā)工作，因為深層過濾步驟可以利用任何堆疊式或互鎖過濾系統和過濾器支架進Holmes、KennethThompson和JonathanZmuda，Thermo附錄：2L下游方案裂解1.收獲時，在培養(yǎng)物中加入10倍裂解緩沖液，直至最終濃3.在培養(yǎng)物中加入核酸酶，直至最終濃度為90U/mL（Benzonase?核酸酶或Pierce通用核酸酶0.8mLPierce通用核酸酶）。4.攪拌裂解液，以確保各種成分充分混合。5.將裂解液倒入兩個2.8L燒瓶中。6.在37℃下將裂解液以125rpm的速度振蕩2小時。離心澄清1.將裂解液以6,000xg的轉速離心30分鐘。2.將含有AAV的上清液倒入0.2μm的Nalgene用深層過濾器進行澄清組裝和平衡過濾系統：1.將管路連接到Millistak+C0SP過濾器的入口、通風口和出2.沖洗Millistak+C0SP過濾器。A.夾住出口管并打開排氣管，開始用去離子（以600L/m2/hr（270mL/min）的流速沖洗C0SP過為確保將所有空氣從過濾器中排出，夾住出口管和排氣管，讓過濾器的壓力上升到<10psi，然后再打開排氣管。繼續(xù)執(zhí)行該步驟，直至過濾器排氣管沒有氣泡排出。用手或橡膠錘輕輕敲擊過濾器也可以B.用DI水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速沖洗C0SP過濾器，同時夾住排氣管并打開保將所有空氣從過濾器中排出，夾住出口管和排氣管，讓過濾器的壓力上升到<10psi，然后再打開出口管。繼續(xù)執(zhí)行該步驟，直至過濾面積為100L/m23.沖洗Millistak+F0HC過濾器。A.將C0SP過濾器的出口管連接至F0HC過濾器的入口處，并在入口前安置一個壓力傳感器。將管路連接至F0HC過濾器的排氣口和出口。B.夾住出口管并打開排氣管，開始用DI水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速沖洗C0SP和F0HC夾住F0HC出口管和排氣管，讓過濾器的壓力上升到<10psi，然后再打開F0HC排氣管。繼續(xù)執(zhí)行該步驟，直至F0HC排氣管沒有氣泡排出。用手或橡膠錘輕輕敲擊過濾器也可以幫助清除過濾器中的氣9C.繼續(xù)用DI水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速沖洗C0SP和F0HC過濾器，同時夾住排氣管并打開F0HC出口管。為確保將所有空氣從F0HC過濾器中排出，夾住F0HC出口管和排氣管，讓過濾器的壓力上升到<10psi，然后再打開F0HC出口管。A.將F0HC過濾器的出口管連接至Sartopore2XLG過濾器的入口，并在入口前安置一個壓力傳感器。將管路連接至Sartopore2XLG過濾器的出口。以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速流經所有三滯留體積（975mL）流經過濾器。澄清處理：1.以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速將所有用核酸酶處理過的細胞裂解液泵入過濾器組。壓力不應超過102.用1.5倍過濾器組滯留體積（1,008mL）淋洗產物。如果澄清的裂解液之前已置于2-8℃的能會出現渾濁，需要使用離心方案或Sartopore2XLG過濾器A.夾住Pp管路，用至少0.25mL/cm2的DI水沖洗中注意：不要讓色譜柱超過其能承受的最大壓力，并3.測試中空纖維過濾器的完整性。A.倒出中空纖維中的所有DI水（注意此時的滯留體入空氣，直至TMP達到5-7psi左右。C.注意TMP在1分鐘內的下降量。下降值為2psi/minA.將Ps管路和Pr管路放入所需的平衡緩沖液中。C.