GB∕T 40472-2021 柱銹菌科實(shí)時(shí)熒光PCR檢疫鑒定方法（正式版）

ICSCCS65.020.01柱銹菌科實(shí)時(shí)熒光PCR檢疫鑒定方法國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40472—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國寧波海關(guān)、中國科學(xué)院微生物研究所、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、中華人民共和國烏魯木齊海關(guān)。1柱銹菌科實(shí)時(shí)熒光PCR檢疫鑒定方法本文件適用于攜帶柱銹菌科病菌的植物及其產(chǎn)品中柱銹菌科病菌的檢測(cè)篩查。本文件沒有規(guī)范性引用文件。本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。柱銹菌科基本信息參見附錄A。6儀器和試劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/L,EDTA,2GB/T40472—2021醇、次氯酸鈉、核糖核酸酶(RNase)、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液：2×TaqManUniversalPCR7檢疫鑒定挑取感病材料放置在2mL離心管內(nèi)，加入100μL左右無菌水混勻并震蕩1h,獲得疑似植物樣品。7.2核酸的制備DNA提取方法按照附錄B中B.1的要求執(zhí)行。7.3DNA純度與濃度的測(cè)定用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度與濃度，分別讀取260nm和280nm處的吸收值(計(jì)為OD260和OD280)。DNA的純度OD260/OD280比值應(yīng)為1.7OD260(pg/mL)。DNA的濃度與純度應(yīng)符合實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的要求。7.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR按照B.2～B.4的方法檢測(cè)。以疑似樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果作為鑒定依據(jù)。9樣品保存與復(fù)核保存植物樣品應(yīng)烘干之后置于2℃~8℃冰箱妥善保存，對(duì)送檢的樣品應(yīng)至少保存6個(gè)月，以備復(fù)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)陽性結(jié)果的照片。由指定的單位或人員負(fù)責(zé)，主要考察實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)記錄及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果等資料的完整性3玄參科(Scrophulariaceae),蘿摩科(Asclepiadaceae),龍膽科(Gentianaceae),芍藥科(Paeoniaceae),殼斗科(Fagaceae),楊梅科(Myricaceae)和檀香科(Santalace[C.harknessii,synonymofEndocronartiumharknessii(J.P.Moore)Hirats.]。4GB/T40472—2021(規(guī)范性)DNA提取方法及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法B.1DNA提取方法將滅菌的鋼珠放在收集樣品的2mL離心管中，將處理過的疑似植物樣品加入400μL2×CTAB異戊醇混合液(24:1),均勻混合3min后，12000r/min離心15min,取上清液至另一離心管中；加入等體積三氯甲烷和異戊醇混合液(24:1),輕輕顛倒混勻，12000r/min離心10min,取上清液至另一離心管中；向上清液中加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混合均勻后于4℃或-20℃沉淀1h,12000r/min50μL無菌水或TE緩沖液(10mmol/LTris.HCl,1mol/LEDTApH8.0)溶解沉淀，-20℃貯存B.2引物及探針序列正向引物Cro-F:5'-GCACTTTATTGTGGCTCTAAACCTT-3';反向引物Cro-R:5'-AACGTACTGTTGAGATGCTATACCAAA-3';探針Cro-P:5'-FAM-CAAAGTTGTTATGTGTGCCTT-MGB-3';探針5'端含有FAM報(bào)告熒光染料，3'端含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子。B.3擴(kuò)增體系后置于熒光PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。以含柱銹菌科的DNA作陽性對(duì)照、不含柱銹菌科的DNA作陰性對(duì)B.4擴(kuò)增反應(yīng)條件注：DNA模板的取量根據(jù)DNA的提取濃度純度而調(diào)節(jié)。不同儀器可根據(jù)儀器要求將反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。5GB/T40472—2021[2]景耀，王培新.馬尾松皰銹病菌及轉(zhuǎn)主寄主研究[J].真菌學(xué)報(bào)，1988,7:112-115.[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第862號(hào)(2007).中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄.[4]AimeMC(2006).Towardresolvingfamily-[5]AimeMC,CastleburyLA,AbbasiM,BegerowD,BerndtR,KirschnerR,MarvanováL,OnoY,PadamseeM,SchollerM,TnamesinPucciniomycotinaandUstilaginomycotina(Basidiomycota)andIMAFungus,9:75-89.[6]CumminsGB,HiratsukaY(2003).Illustratedgeneraofrustfungi,3rdedn,AmericanPhy-topathologicalSociety,[7]FarrDF,RossmanAY(2019).FungalDatabases,U.S.NationalFungusCollections,ARS,USDA./fungaldatabases/.AccessedFebruary2019.[8]HiratsukaY(1995).Pinestemrustsoftheworld-frameworkforamonograph,Proceedingsofthe4thIUFRORustofPinesWorkingPartyConference,Tsukuba,1-8.[9]LaundonGF(1976).Peridermium(fungi).Taxon,25:186-187.[10]KirkPM,CannonPF,MinterDW,etal.(2008).Dictionaryofthefungi,10thedn.CABI,Wallingford,UK.[11]PetersonRS(1967).ThePeridermicalClub,94:511-542.[12]PetersonRS(1973).StudiesofCronartium(Uredinales),ReportsoftheTottoriMycologi-calInstitute,10:203-223.[13]PetersonRS,JewellFF(1968).StatusofAmericanstemrustsofpine,AnnualReviewofPhytopathology,6:23-40.[14]QiXH,CaiL,ZhaoP(2019).Quasipucciniastrumagrimoniae,gen.etsp.nov.onAgrimonia(Rosaceae)fromChina.Mycology,10:1-10.[15]